[发明专利]一种用于显微注射的松材线虫虫体固定方法

说明书

本发明公开了一种用于松材线虫显微注射的虫体固定方法，属于生物技术领域，具体涉及以下步骤：利用SDS‑DTT溶液软化线虫的角质层；利用pronase E溶液消解线虫角质层；制备3％琼脂糖为主要原料的固定垫；用睫毛针将虫体从水中挑至固定垫上；在解剖镜下用睫毛针快速下压活动虫体；在虫体全身水膜被固定垫吸收的同时覆盖上注射油。本发明成功固定松材线虫，固定率≥80％，注射后松材线虫的存活率≥80％。

技术领域

本发明涉及一种用于显微注射的松材线虫虫体固定方法，具体涉及分子生物学技术领域。

背景技术

松材线虫Bursaphelenchus xylophilus是一种生活在松树体内的寄生性线虫，松树被松材线虫感染之后，最快在两个月内即可发病死亡。松材线虫成虫虫体长约1mm，雌虫尾部近圆锥形，末端圆；雄虫尾部似鸟爪，向腹面弯曲。松材线虫借助松墨天牛等媒介昆虫实现在松树之间的传播，并引发松材线虫病的流行。被松材线虫感染的松树针叶呈黄褐色或红褐色，整株干枯死亡。

作为一种重要的病原线虫，松材线虫的基础生物学研究是当前森林病理学研究的前沿和热点。然而，由于缺乏有效的虫体固定技术，国内外尚不能够对松材线虫开展转基因显微注射研究，这极大地制约了一些关键基因的表达特性和功能验证等基础理论研究，也为进一步在分子水平上开展特异性的松材线虫病防控技术研究设置了障碍。

在线虫的虫体固定和转基因显微注射研究方面，国内外研究最多的当属模式线虫秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans。目前，秀丽隐杆线虫的显微注射技术已经广泛应用于基因表达、基因功能验证和基因互作等方面的研究。秀丽隐杆线虫体壁薄，虫体在注射油中的活动能力不强，虫体固定的效率高，操作步骤简易。现有的秀丽隐杆线虫虫体固定方法是：直接用睫毛针从培养基板中挑取一条雌雄同体线虫，在解剖镜下放置于已添加注射油的2％琼脂糖固定垫中，由于虫体密度比注射油大且虫体体表成分可与固定垫相互黏附，故虫体会自然下沉并黏附于固定垫表面，虫体固定步骤操作简单，固定效率高。

在自然条件下，松材线虫生活于松树体内，而秀丽隐杆线虫生活于土壤中，在长期的适应性进化过程中，松材线虫形成了与秀丽隐杆线虫截然不同的体表组织。与秀丽隐杆线虫相比，松材线虫的体壁坚硬厚实，体表角质层成分复杂多样，蛋白含量高，与2％琼脂糖固定垫的粘合度差。另外，与秀丽隐杆线虫相比，松材线虫的活动能力更强，很容易挣脱固定垫的束缚。因此，采用上述秀丽隐杆线虫的显微注射虫体固定技术无法有效实现对松材线虫的固定，固定率≤10％。由于固定效果差，松材线虫在注射的过程中仍然处于活动状态，无法准确注射到正确部位，对虫体造成较大的机械损伤，注射后虫体的存活率≤20％。

发明内容

本发明针对上述瓶颈问题，提出了一种专门用于显微注射的松材线虫虫体固定方法，可以有效地解决松材线虫注射前的虫体固定这一难题，有效提高对松材线虫的虫体固定效果。

具体的技术方案如下：

一种用于显微注射的松材线虫虫体固定方法，采用琼脂糖水溶液制成的固定垫来固定松材线虫虫体。

进一步的，松材线虫虫体固定方法包括以下步骤：

1)虫体选择与清洗：挑选健康活跃的松材线虫成虫，滤除线虫悬液中的菌丝杂质，再用无菌水清洗松材线虫2-3遍，浓缩于1.5ml离心管中备用；该步骤中的浓缩是指将多余的无菌水弃去，然后将剩余的无菌水及松材线虫一起装于1.5ml的离心管中，剩余的无菌水要将松材线虫淹没；

2)角质层软化：用SDS-DTT溶液室温黑暗条件下处理松材线虫1h，再用无菌水清洗2-3遍；

3)角质层消解：用pronase E溶液室温处理松材线虫5h，并用无菌水清洗2-3遍，进一步软化并消解角质层，让松材线虫坚硬厚实的外表皮变得粗糙薄弱，有利于更好地固定；