[发明专利]基于高通量测序的DNA甲基化检测方法

权利要求书

1.一种基于高通量测序的DNA甲基化检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)用亚硫酸氢盐处理待测基因组DNA，亚硫酸氢盐将DNA中未甲基化的胞嘧啶(C)转化成尿嘧啶(U)，而甲基化胞嘧啶保持不变，从而使得最初互补的单链DNA不再互补，从而得到单链DNA；

2)用T4核酸激酶处理单链DNA使3’端去磷酸化得到3’端去磷酸化DNA；

3)用末端转移酶TDT延伸3’端去磷酸化DNA，在3’端引入核苷酸同聚物序列；

4)将3’端引入核苷酸同聚物序列的DNA用5’端生物素修饰的、含有第一公共接头序列的以及含有与3’末端引入核苷酸同聚物序列互补序列的引物PrimerU1G进行杂交退火，并用DNA聚合酶进行延伸；

5)循环延伸线性增加延伸产物量；

6)纯化去除未延伸的单链延伸引物；

7)通过5’端生物素修饰将延伸的引物序列结合到链霉亲合素包被的磁珠上，通过DNA变性分离非结合链；

8)用末端转移酶TDT延伸结合在链霉亲合素磁珠上的单链DNA片段，在3’末端引入核苷酸同聚物序列；

9)用含有第二公共接头序列和含有与3’端引入的核苷酸同聚物序列互补序列的引物Primer U2A与固定在磁珠上的单链DNA互补区域杂交，并加入DNA聚合酶进行延伸；

10)用含有第一个测序接头序列和第二个测序接头序列的PCR引物扩增延伸的DNA产物制备出基因组甲基化特异的DNA测序文库；

11)对PCR扩增文库进行高通量测序确定DNA片段的序列。

2.根据权利要求1所述的基于高通量测序的DNA甲基化检测方法，其特征在于，所述步骤3)中在3’端引入核苷酸同聚物序列时使用的延伸底物为dATP、dCTP、dGTP、或dTTP中的一种。

3.根据权利要求1所述的基于高通量测序的DNA甲基化检测方法，其特征在于，所述步骤4)中的引物Primer U1G中的第一公共接头序列为与第一个测序接头序列部分相同、完全相同、部分互补、或完全互补的序列；所述步骤9)中的引物Primer U2A包含的第二公共接头序列为与第二个测序接头序列部分相同、完全相同、部分互补、或完全互补的序列。

4.根据权利要求1所述的基于高通量测序的DNA甲基化检测方法，其特征在于，所述步骤4)中的引物Primer U1G中还包含有DNA分子标签序列，所述DNA分子标签序列以短链随机碱基的形式插入到引物Primer U1G中。

5.根据权利要求1所述的基于高通量测序的DNA甲基化检测方法，其特征在于，所述DNA分子标签序列包含简并性碱基D，其中D＝A+G+T。

6.根据权利要求1所述的基于高通量测序的DNA甲基化检测方法，其特征在于，所述步骤4)中延伸使用的DNA聚合酶为高保真DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、Klenow聚合酶、DNA聚合酶I、Klenow聚合酶(exo-)中的一种。

7.根据权利要求1所述的基于高通量测序的DNA甲基化检测方法，其特征在于，所述步骤5)中的循环延伸次数为1-10个循环。

8.根据权利要求1所述的基于高通量测序的DNA甲基化检测方法，其特征在于，所述步骤6)中纯化去除未延伸的单链延伸引物的方法为用AMpure XP beads纯化去除未延伸的单链延伸引物或采用外切酶I切除单链引物去除未延伸的单链延伸引物。

9.根据权利要求1所述的基于高通量测序的DNA甲基化检测方法，其特征在于，所述步骤8)中3’端引入核苷酸同聚物序列时使用的延伸底物为dATP、dCTP、dGTP、或dTTP中的一种。

10.根据权利要求1所述的基于高通量测序的DNA甲基化检测方法，其特征在于，所述步骤11)中对PCR扩增文库进行高通量测序前需要对扩增的DNA测序文库进行纯化和质控。