[发明专利]一种膀胱原代神经元的分离提取方法

权利要求书

1.一种膀胱原代神经元的分离提取方法，包括以下步骤：

(1)取膀胱体，以无菌的克氏液洗涤后剪碎，得到预处理膀胱样品；

(2)以二型胶原酶消化所述预处理膀胱样品，离心弃去上清，得到第一消化物；

所述二型胶原酶的浓度为1～5mg/ml，二型胶原酶的体积与预处理膀胱样品的质量之比为1～5ml：1g；

所述二型胶原酶消化的时间为60min；

(3)以胰蛋白酶消化所述第一消化物3～7min，离心弃去上清，得到第二消化物；

(4)将所述第二消化物与神经元完全培养基混合，细胞过滤器过滤，将过滤液摇床培养20～40min后，离心弃去上清，所得沉淀以神经元完全培养基重悬后加入到预先包被有多聚-D-赖氨酸和层黏连蛋白的细胞爬片上培养4～7d，培养48h后全量换液，培养48～96h后再次全量换液；

所述神经元完全培养基以Neurobasal-A培养基为基础培养基，还包括：质量浓度1～3％的B-27型无血清添加剂、质量浓度0.2～2％的L-谷氨酰胺、质量浓度0.05～0.2％的GDNF和质量浓度1～5％的100×抗菌-抗真菌剂。

2.根据权利要求1所述的分离提取方法，其特征在于，步骤(3)中，所述胰蛋白酶消化终止时，采用加入4℃缓冲液培养基的方式终止消化；

所述缓冲液培养基以F12培养基为基础培养基，还包括：质量浓度5～12％的胎牛血清和0.5～3％的100×抗菌-抗真菌剂。

3.根据权利要求2所述的分离提取方法，其特征在于，步骤(3)中，所述缓冲液培养基的加入量为胰蛋白酶和第一消化物总体积的2倍以上。

4.根据权利要求1所述的分离提取方法，其特征在于，所述细胞过滤器的内径为40～100μm。

5.根据权利要求1所述的分离提取方法，其特征在于，步骤(2)中，所述消化在37℃、5％CO₂培养箱中摇床消化。

6.根据权利要求1所述的分离提取方法，其特征在于，步骤(3)中，所述按照预处理膀胱样品的质量与神经元完全培养基的体积之比1g：0.1～2ml的比例，将第二消化物与神经元完全培养基混合。