[发明专利]小型猪2型糖尿病模型的构建方法及应用

权利要求书

1.构建猪2型糖尿病模型的方法，包括如下步骤：将GIPR^dn蛋白的编码基因、hIAPP蛋白的编码基因和PNPLA3^I148M蛋白的编码基因整合到目的猪的基因组中，获得转基因阳性猪，进而得到猪2型糖尿病模型。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述GIPR^dn蛋白的编码基因、所述hIAPP蛋白的编码基因和所述PNPLA3^I148M蛋白的编码基因被定点整合到所述目的猪的基因组的H11位点。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

(A1)将所述GIPR^dn蛋白的编码基因、所述hIAPP蛋白的编码基因和所述PNPLA3^I148M蛋白的编码基因定点整合到所述目的猪的胎儿成纤维细胞的基因组H11位点，得到重组细胞；

(A2)将所述重组细胞的细胞核注入猪的去核受精卵中，经培养所得胚胎植入代孕母猪体内，孕育得到F0代猪；

(A3)将所述F0代猪与新的所述目的猪进行杂交，从所得F1代猪中获得所述GIPR^dn蛋白的编码基因、所述hIAPP蛋白的编码基因和所述PNPLA3^I148M蛋白的编码基因被定点整合到基因组H11位点的杂合体猪；

进一步地，所述方法在步骤(A3)之后还包括如下步骤(A4)：

(A4)将雄性的所述杂合体猪与雌性的所述杂合体猪进行一次或多次杂交，从杂交后代中获得所述GIPR^dn蛋白的编码基因、所述hIAPP蛋白的编码基因和所述PNPLA3^I148M蛋白的编码基因被定点整合到基因组H11位点的纯合体猪；

所述转基因阳性猪为步骤(A3)中的所述杂合体猪或步骤(A4)中的所述纯合体猪。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：在所述猪2型糖尿病模型的基因组中，所述GIPR^dn蛋白的编码基因和所述hIAPP蛋白的编码基因位于同一表达盒内，由PIP启动子启动表达；所述PNPLA3^I148M蛋白的编码基因位于另一表达盒内，由P-ApoE启动子启动表达；

进一步地，所述PIP启动子的核苷酸序列为SEQ ID No.4的第6396-7881位；和/或

进一步地，所述P-ApoE启动子的核苷酸序列为SEQ ID No.4的第1289-2925位。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述GIPR^dn蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；

和/或

所述hIAPP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；

和/或

所述PNPLA3^I148M蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；

和/或

所述GIPR^dn蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.4的第7974-9347位；

和/或

所述hIAPP蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.4的第9456-9722位；

和/或

所述PNPLA3^I148M蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.4的第2926-4368位。

6.根据权利要求3-5中任一所述的方法，其特征在于：在步骤(A1)中，所述GIPR^dn蛋白的编码基因、所述hIAPP蛋白的编码基因和所述PNPLA3^I148M蛋白的编码基因是通过CRISPR/Cas9技术被定点整合到所述目的猪的胎儿成纤维细胞的基因组H11位点的；其中，针对猪基因组H11位点的gRNA的靶序列如SEQ ID No.5所示；用于同源重组的Donor载体的全序列如SEQ ID No.4所示。