[发明专利]小鼠原代肝细胞的分离方法及其制得的小鼠原代肝细胞与应用

说明书

本发明提供了一种小鼠原代肝细胞的分离方法及其制得的小鼠原代肝细胞与应用，涉及原代细胞分离技术领域。小鼠原代肝细胞的分离方法，包括如下步骤：将麻醉小鼠依次进行腹腔暴露、肝周管结扎、原位三步灌流和细胞分离得到小鼠原代肝细胞；原位三步灌流依次包括第一灌流，第二灌流和第三灌流；第一灌流，用第一灌流液去除红细胞，并对血液进行抗凝；第二灌流，用第二灌流液去除抗凝剂，并对肝组织进行初步消化；第三灌流，用第三灌流液进一步消化。该小鼠原代肝细胞的分离方法缓解了现有技术中缺乏一种分离后细胞活性高、贴壁迅速、存活细胞收率高、分离成本低并且分离过程不易污染的小鼠原代肝细胞分离方法的技术问题。

技术领域

本发明涉及原代细胞分离技术领域，具体而言，涉及一种小鼠原代肝 细胞的分离方法及其制得的小鼠原代肝细胞与应用。

背景技术

小鼠原代肝细胞在生命科学技术领域应用广泛，其制备技术是目前许 多科学实验中的基本流程，应用非常广泛。

目前，小鼠原代肝细胞的分离方法有以下几种：(1)液氮研磨法：该 方法因使用到液氮成本较高，而且研磨时部分组织会粘在研钵和研棒上产 生一定的肝组织浪费，同时在液氮研磨过程中经常由于补充液氮不及时可 能导致研钵内干涸进而导致细胞受热而活性降低甚至死亡，进一步降低分 离制得的原代肝细胞的细胞活性，以及存活肝细胞收率，不适于原代肝细 胞的大量在制备。(2)胰酶消化法：该方法应用胰酶成本较高，而且在胰 酶消化过程中，经常出现外部细胞消化过度，而内部细胞难以消化的现象， 降低了分离制得的原代肝细胞的细胞活性，以及存活肝细胞收率。(3)离 体灌流法：该方法在分离肝脏时，容易发生菌类污染，无菌操作不便利， 而且经常导致肝被膜破碎，导致灌流失败。此外，灌流时采用后腔静脉进 行灌注，后腔静脉较粗，灌流液从较粗血管进入较细的血管的过程中，可 能由于灌流液速度和动力发生改变，从而导致肝细胞破损，而且灌流过程 中一旦血管破损由于血压过大会导致出血过多，不易于灌流针刺入和结扎， 降低实验效率，延长实验时间，时间的延长导致得到的原代肝细胞的活性 降低，同时也降低存活肝细胞的收率，而且现有的灌流液经常导致消化不 完全，这进一步降低了分离制得的存活肝细胞的收率。

因此，开发一种有效提高分离制得的原代肝细胞的细胞活性，使分离 的细胞能够更迅速贴壁，同时能够有效提高存活肝细胞的收率，降低小鼠 肝细胞的制备成本，适宜于大量小鼠原代肝细胞的制备，而且不易造成菌 类污染的小鼠原代肝细胞分离方法具有重要的科研价值和实际应用价值。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的之一在于提供小鼠原代肝细胞的分离方法，该方法将麻 醉小鼠依次进行腹腔暴露、肝周管结扎、原位三步灌流和细胞分离得到小 鼠原代肝细胞；原位三步灌流依次包括第一灌流，第二灌流和第三灌流； 第一灌流，用第一灌流液去除红细胞，并对血液进行抗凝；第二灌流，用 第二灌流液去除抗凝剂，并对肝组织进行初步消化；第三灌流，用第三灌 流液进一步消化。该小鼠原代肝细胞的分离方法能有效提高分离的到的小鼠原代细胞的活性，使其贴壁更迅速，原代细胞收率高，适合较大的实验 用量需求，并且分离过程中不易产生菌类污染；此外，该方法兼具程序简 单，成本低的优势。

本发明目的之二在于提供上述小鼠原代肝细胞分离方法制得的小鼠原 代肝细胞。

本发明的目的之三在于提供上述小鼠原代肝细胞在细胞生物学试验或 病毒学试验中的应用。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

第一方面，提供了一种小鼠原代肝细胞的分离方法，包括如下步骤： 将麻醉小鼠依次进行腹腔暴露、肝周管结扎、原位三步灌流和细胞分离得 到小鼠原代肝细胞；

原位三步灌流依次包括第一灌流灌流，第二灌流和第三灌流；

第一灌流，用第一灌流液去除红细胞，并对血液进行抗凝；