[发明专利]一种快速检测核酸的(RT)RAA-CRISPR系统

说明书

本发明公开了一种快速检测核酸的(RT)RAA‑CRISPR蛋白酶系统，包括常温恒温扩增系统和CRISPR检测系统；CRISPR检测系统设置在常温恒温扩增系统的下游；其中常温恒温扩增系统包括核酸扩增系统和RNA转录系统；其中CRISPR检测系统包括RNA引导序列、检测蛋白Cas13和RAA探针。本发明将CRISPR‑Cas系统与(RT)RAA恒温核酸扩增有机结合，在保证痕量高灵敏度、高特异性检测的情况下，极大的降低对时间及环境的要求，使得利用基因分子检测技术建立快速、低耗的现场病毒核酸检测技术真正成为可能。

技术领域

本发明涉及体外诊断试剂领域，更具体的说是涉及一种快速检测核酸的(RT)RAA-CRISPR蛋白酶系统。

背景技术

基因分子检测是当代医学发展的重要前沿领域之一，是利用基因工程及分子生物学等理论和技术，通过直接探查核酸序列的存在或变化，从而对人体状态与疾病做出诊断的方法。其广泛用于现场诊断、床旁诊断、同伴诊断、个体化医疗诊断等多个方面，为疾病的预测、诊断、预防、治疗、预后和转归提供了重要信息和决策依据。

目前，基因分子检测技术的市场需求不断增加，发展趋势也日益精准化、便携化、微量化和一体化。而现有技术多存在弊端。简单、快捷的诊断方法往往敏感度不高，而高敏感度检测方法对环境及仪器的高要求又使其存在局限性。复杂多变的诊断环境，限制了基因分子检测技术的应用，同时也对技术的发展提出了挑战。

其中，CRISPR-Cas系统存于大约90％的古菌和40％的细菌中，作为一种原核生物抵御病毒等外源入侵核酸的获得性免疫系统而存在(Van der Oost J et al.,2014；Barrangou Ret al.,2014)。CRISPR-Cas系统被划分为三个主要类型：I型，II型和III型；它们分别有一个标志性蛋白：Cas3，Cas9和Cas10(Makarova KS et al.,2011)。其中CRISPR-Cas9系统，(Deltcheva E et al.,2011；Gasiunas G et al.,2012)，被广泛开发成真核生物基因组编辑工具(Jinek M et al.,2012；Wang H et al.,2013)。而最近发现的Cas13蛋白，同样属于CRISPR系统II型，它有一个突出的特点：在切开特异性RNA双链序列后，仍能保持RNA酶切活性，且不具备特异性。借助此特性可以针对特定序列的靶标核酸进行检测(J.S.Gootenberg et al.，2017)。然而虽然可利用CRISPR-Cas13系统，可以针对特定序列的靶标核酸进行检测，但是因为整个系统对靶标核酸浓度要求比较高，也就导致了CRISPR-Cas13检测限过高，敏感性很差。

重组酶介导扩增(Recombinase-aid Amplification，RAA)技术也是一种在恒温下可以使核酸快速扩增的方法。与RPA不同的是，RAA扩增法使用的是从细菌或真菌中获得的重组酶，在37℃恒温下，该重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白(single-strandedDNAbinding，SSB)的帮助下，使模板DNA解链，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，反应产物也是以指数级增长，通常在1h内即能得到可以用琼脂糖凝胶电泳检测到的扩增片段。

因此，如何将CRISPR-Cas系统与(RT)RAA恒温核酸扩增技术有机结合，在保证痕量高灵敏度、高特异性检测的情况下，极大的降低对时间及环境的要求是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容