[发明专利]利用CRISPR/Cas9系统大片段敲除绵羊MSTN基因的方法

权利要求书

1.一种利用CRISPR/Cas9系统大片段敲除绵羊MSTN基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、根据NCBI中绵羊基因组序列，选择绵羊基因组中MSTN基因第一外显子，第二外显子和第三外显子作为靶位点设计sgRNA；

S2、构建sgRNA的体外转录载体pUC57-T7-sgRNA和pST1374-NLS-flag-linker-Cas9以及载体Cas9mRNA；

S3、利用构建好的载体pUC57-T7-sgRNA和Cas9mRNA的体外转录载体pST1374-NLS-flag-linker-Cas9进行以T7启动子介导的体外转录并进行纯化；得到sgRNA；

S4、将sgRNA、Cas9mRNA混合，注射入绵羊受精卵细胞质中，然后经体外培养后移植入同种雌性绵羊输卵管中，用于生产大片段敲除MSTN的转基因绵羊。

2.根据权利要求1所述的利用CRISPR/Cas9系统大片段敲除绵羊MSTN基因的方法，其特征在于，所述步骤S1中的sgRNA分别位于羊MSTN基因的第一外显子，第二外显子和第三外显子上。

3.根据权利要求1所述的利用CRISPR/Cas9系统大片段敲除绵羊MSTN基因的方法，其特征在于，所述步骤S1中的sgRNA包括MSTN-sg1、MSTN-sg2和MSTN-sg3，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

4.根据权利要求1所述的利用CRISPR/Cas9系统大片段敲除绵羊MSTN基因的方法，其特征在于，所述步骤S4中的sgRNA、Cas9mRNA混合后，终浓度为Cas9mRNA25ng/μL，sgRNA10ng/μL。

5.特异性靶向MSTN基因第一外显子，第二外显子和第三外显子的sgRNA寡核苷酸序列，其特征在于，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

6.含有权利要求5所述sgRNA的体外转录载体。

7.用于敲除MSTN基因的CRISPR/Cas9表达系统，其特征在于，所述sgRNA的表达载体为pUC57-T7-gRNA，Cas9蛋白的体外转录载体为pST1374-NLS-flag-linker-Cas9。

8.权利要求1-4任一项所述的利用CRISPR/Cas9系统大片段敲除绵羊MSTN基因的方法或权利要求7所述的用于敲除MSTN基因的CRISPR/Cas9表达系统在生产大片段敲除MSTN的转基因绵羊中的应用。