[发明专利]一种绿原酸对心肌肥大的保护作用研究方法

说明书

本发明涉及心肌健康技术领域，且公开了一种绿原酸对心肌肥大的保护作用研究方法，通过H9C2心肌细胞的培养、原代心肌细胞的分离培养、细胞核蛋白的抽提、MTT法检测Iso和CGA药物毒性、细胞免疫荧光、试验分组及药物处理、细胞划痕、流式细胞术检测细胞凋亡、蛋白免疫印迹、荧光定量聚合酶链式反应、细胞内活性氧水平检测和数据分析的步骤来观察绿原酸对心肌肥大的保护作用与效果，同时也确保绿原酸对心肌的危害性，该一种绿原酸对心肌肥大的保护作用研究方法，通过在冰箱中使用冻存液保存细胞，冻存液采用70％DMEM培养基、20％的胎牛血清和10％的DMSO，DMSO可以有效防止细胞内冰晶形成而损伤细胞。

技术领域

本发明涉及心肌健康技术领域，具体为一种绿原酸对心肌肥大的保护作用研究方法。

背景技术

心肌肥大是心血管疾病的独立危险因素，缓解和预防心肌肥大是治疗心力衰竭等恶性心脏疾病最有效的阶段，因此寻找有效的保护药物和研究心肌肥大产生、发展的分子机制具有极其重要的意义。课题组经过查阅文献、归纳分析，筛选出数种在病理学和心血管疾病保护中研究比较活跃中草药成分。对候选药物预实验的结果分析，确定CGA作为Iso诱导心肌肥厚的保护性药物，CGA是中草药组分中具有广泛生物活性的小分子酚类物质。在课题的研究中发现CGA能够有效地抑制Iso诱导的心肌肥厚，CGA预处理组的心肌细胞在经过同浓度Iso药物等时间的诱导后，其心肌细胞在体积和选择的标记物分子表达水平上都显著小于或低于Iso药物直接诱导心肌细胞组，都更接近于正常培养的心肌细胞，CGA对心肌细胞的预处理能够有效地抵抗Iso刺激的变化。在对这一现象分子机制的初步研究中发现，CGA在保护心肌肥大发生的过程中，显著地抑制了Iso诱导的心肌细胞内氧自由基水平，能够在一定的时间内使细胞内氧自由基水平维持在正常细胞的水平。检测到CGA的预处理能够抑制Iso诱导的NF-κB向细胞核内的转运，从而阻断Iso 诱导导致的NF-κB激活。这一研究结果表明CGA可能是预防心肌肥大的保护性药物，在得到CGA对Iso 诱导的心肌细胞肥大有保护作用后，课题开始研究CGA对活体心脏的作用效应。经过设计实验分组、摸索 Iso和CGA浓度，活体心脏超声结果显示，所采用的Iso浓度和注射诱导时间能够显著提高小鼠心脏的射血分数和心脏左室缩短分数，表明该条件下使得正常的心脏走向了心肌肥厚代偿性早期。而经过提前注射一定剂量的CGA能够遏制左室壁的增厚、射血分数和缩短分数的增大，维持正常的状态。这一结果预示着日常服用CGA很可能具有保护心肌细胞的功能，已知CGA能够预防心肌肥大的发生，课题转向心肌肥大分子机理方面的探索。由于蛋白质合成的增加是心肌肥大的一个重要特征，于是课题集中围绕心肌细胞蛋白质降解方面开展，旨在挖掘使得蛋白质降解受阻的新基因。通过生物信息学策略筛选出与心肌肥大相关的基因Ube3a，经过实验验证发现：在大鼠心肌细胞肥大过程中，Ube3a基因在转录和翻译水平均表达上调。于是采取将Ube3a敲除和过表达，然后检测心肌细胞的变化以及再次通过Iso诱导再检测心肌肥大的发生情况。结果表明Ube3a的敲除能够促进Iso诱导的心肌肥大发生程度，而Ube3a过表达能够阻止心肌肥大的发生。同时，也检测到随着心肌细胞内Ube3a的敲除和过表达，MMP-9也会发生与心肌肥大标记物分子表达相似的趋势。这些结果表明Ube3a基因表达的变化可能是引发心肌肥大的原因，Ube3a能够保护Iso 诱导的心肌细胞肥大，而且MMP-9可能参与了心肌肥大发生的过程，这一研究为心肌肥大分子机理的进一步阐明提供了更多的数据支撑，也为治疗心肌肥大提供了新的基因靶向。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种绿原酸对心肌肥大的保护作用研究方法，具备找到了心肌肥大的治疗方向等优点，解决了心肌肥大不易治疗的问题。

(二)技术方案

为实现上述上述目的，本发明提供如下技术方案：一种绿原酸对心肌肥大的保护作用研究方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1、H9C2心肌细胞的培养；

S2、原代心肌细胞的分离培养；