[发明专利]EFTUD2启动子的转录活性的鉴定方法

说明书

本发明提供一种EFTUD2启动子的转录活性的鉴定方法，包括以下步骤：（1）构建EFTUD2启动子报告基因重组载体；（2）瞬时转染以及（3）双荧光素酶报告基因活性检测。本发明EFTUD2启动子的转录活性的鉴定方法为阐明EFTUD2基因的表达调控机制奠定了坚实的基础，也有助于进一步研究EFTUD2表达水平与固有免疫的关系以及差异性剪接的具体机制。

技术领域

本发明涉及生物基因技术领域，尤其涉及一种EFTUD2启动子的转录活性的鉴定方法。

背景技术

EFTUD2(Elongation factor Tu GTP-binding domain-containing2)基因编码GTP酶，GTP酶是U5小核核糖核蛋白(small nuclear ribonucleoprotein，snRNP)即剪接体复合物的一个组成部分，与剪接体的其余部分一起发挥作用剪接前体mRNA(precursormessager RNA，pre-mRNA)以产生成熟mRNA。在剪接过程中，EFTUD2既可以直接参与剪接加工也可以参与剪接体snRNP再循环过程。EFTUD2作为GTP水解酶的一种，作用类似于剪接体易位酶，既能介导RNA或蛋白质的构象变化，促进U1与前RNA的5’剪接位点碱基配对，又能促进U4与U6碱基配对的分离，从而构成5’剪接位点、U6及U2催化核心结构，而这一结构能避免剪接复合体过早的活化。因此，EFTUD2是成熟剪接体组装生物过程中不可缺少的成分。

目前，关于EFTUD2基因变体的研究有相当多的报道，已经文献报道发现TreacherCollins，Nager，CHARGE或Feingold综合征或眼球神经纤维谱的差异诊断患者存在EFTUD2突变，并有研究表明EFTUD2基因突变可导致MFDGA(Mandibulofacial dysostosisGuion-Almeida型；OMIM 610536)畸形，而某些基因突变导致的表型差异都证实了有剪接体的参与。另有研究证实宿主基因转录后调控即前体mRNA剪接所导致的固有免疫相关蛋白差异性表达在机体抵抗外来病毒感染入侵时起到了至关重要的作用。因此，EFTUD2基因在遗传畸形以及调节固有免疫方面扮演着重要角色。因此，研究并阐明EFTUD2基因的表达调控机制具有重要的生物学意义，但是，目前并没有相关研究报道。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种EFTUD2启动子的转录活性的鉴定方法。

为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明提供一种EFTUD2启动子的转录活性的鉴定方法，该鉴定方法包括以下步骤：

(1)构建EFTUD2启动子报告基因重组载体

A1.引物的设计与合成：根据生物信息学分析得到的EFTUD2pro-2.0kb启动子序列，设计覆盖目的基因全长的上下游引物，并根据预测的EFTUD2pro-0.5kb、EFTUD2pro-1.0kb、EFTUD2pro-1.5kb启动子序列分别设计三对扩增引物，其中目的基因上下游引物分别加有双荧光素酶报告基因载体psiCHECK-2上BglII和NheI限制性酶切位点两侧同源序列；

B1.全基因合成与PCR扩增获取目的启动子序列：采用多重PCR全基因合成目的启动子序列EFTUD2pro-2.0kb，并以EFTUD2pro-2.0kb序列为模板，PCR扩增目的启动子序列EFTUD2pro-0.5kb，EFTUD2pro-1.0kb，EFTUD2pro-1.5kb；

C1.载体构建：通过BglII和NheI双酶切，将扩增回收好的目的启动子序列重组克隆到双荧光素酶报告基因载体psiCHECK-2中，构建含EFTUD2启动子序列和双荧光素酶报告基因的EFTUD2启动子报告基因重组载体；

(2)瞬时转染：将构建好的各EFTUD2启动子报告基因重组载体分别转染HepG2细胞；以及

(3)双荧光素酶报告基因活性检测