[发明专利]一种CRM197菌种培养基、配制方法及发酵培养方法

说明书

本发明涉及生物制药和微生物培养技术领域，特别涉及一种CRM197菌种培养基、配制方法及发酵培养方法。CRM197菌种培养基为液体培养基，每升培养基中包括以下配方的组分：250mL基础营养液、7.2mL乙酸、30g一水麦芽糖、2mL乳酸钠、0.5g酪氨酸、1.96g磷酸二氢钾、5.1g磷酸氢二钾、6.13mL生长因子a、8mL生长因子b、8mL生长因子c和1.3g氯化钙。该培养基在制备时能使得各组分快速溶解，保证培养基的均一性。本申请中CRM197菌种的发酵培养方法采用逐级放大的发酵培养扩增模式，具有快速、便捷、成本低、高效的特点，便于CRM197菌种的大规模扩增，从而获得高表达量的发酵菌液。

技术领域

本发明涉及生物制药和微生物培养技术领域，特别涉及一种CRM197菌种培养基、配制方法及发酵培养方法。

背景技术

白喉毒素(DT)是由白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)的产毒菌株合成和分泌的蛋白质性毒素，其以单一多肽的形式产生，且该多肽易于被剪接，在190、192或193残基处裂解，结果形成由二硫键连接的两个亚基A片段和B片段(Moskaug等Biol.Chem.264：15709-15713，1989)。A片段为催化活性部分，是依赖NAD的ADP-核糖基转移酶，其特异性靶向蛋白质合成因子EF-2，从而使EF-2失活，细胞中的蛋白质则合成停止。

CRM197为白喉毒素的无毒形式，但其在免疫上与白喉毒素没有区别。CRM197由不产毒噬菌体β197tox感染的白喉棒杆菌产生，而β197tox是通过对产毒棒状噬菌体进行亚硝基胍诱突创造的(Uchida等Nature New Biology(1971)233；8-11)。CRM197蛋白具有与白喉毒素相同的分子量，但其结构基因不同，其中有单碱基变化。这导致52位的氨基酸从甘氨酸变为谷胺酰胺，使A片段不能结合NAD，因此无毒(Pappenheimer 1977，AnnRev，Biochem.46；69-94，RappuoliApplied and Environmental Microbiology Sept 1983p560-564)。

由于没有毒性的CRM197蛋白仍然可与敏感细胞的受体结合，即CRM197蛋白在丧失酶活性及毒性的同时仍保留白喉毒素的免疫原性，因此是一种理想的多糖结合疫苗载体蛋白。

目前，我国公布的有关生产CRM197的方法专利有：

2006年03月21日，国家知识产权局公布了葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司P·M·H·德霍泰等用于生产白喉类毒素的方法专利，专利申请号为200680017793.1，此专利涉及CRM197的发酵方法，包括在发酵罐中的培养白喉棒杆菌(Corynebacteriumdiphtheria)菌株的发酵方式以及培养基的配方，该培养方式足以维持均质培养物的搅动和限量通气以便培养物中的pO2在大部分发酵过程中能够降低到4％以下，直至完成发酵。

2007年07月18日，国家知识产权局公布了海南天源康泽医药科技有限公司李模孝等白喉毒素突变体CRM197及其制备方法专利，专利申请号为200610042194.7，此专利以大肠杆菌为出发菌，以包涵体形式表达白喉毒素突变体CRM197，目标产物序列为长度536个氨基酸，具有白喉毒素的免疫原性而不具有白喉毒素的毒性。该发明克隆了编码CRM197的基因，构建表达CRM197的重组表达质粒并转化至大肠杆菌表达宿主中以包涵体形式表达。目的蛋白在蛋白总含量中占24％以上，CRM197更易于纯化，纯度易于达到95％以上，目的蛋白回收率高。

然而，无论是天然的CRM197菌种还是重组构建的CRM197工程菌，在实际的菌种发酵过程中，培养方式是制约其高量产的重要一环。因此，研发出一种恰当的培养方式，使CRM197菌种得以大规模扩增而获得高表达量的发酵菌液是本发明所要解决的问题。

发明内容