[发明专利]以苯并噻唑基硫代羧酸为功能配基的层析介质及其制备方法

说明书

本发明公开了一种以苯并噻唑基硫代羧酸为功能配基的层析介质及其制备方法。以亲水性多孔微球为层析基质，依次加入二甲基亚砜和烯丙基溴进行活化；活化的层析基质与N‑溴代丁二酰亚胺反应，进行溴代醇化；将溴代醇化后的层析基质与己二胺溶液混合，进行氨基化；进一步将氨基化基质偶联苯并噻唑基硫代羧酸配基；最后采用乙酸钠和乙酸酐溶液对未反应的氨基进行封闭，得到以苯并噻唑基硫代羧酸为功能基团的层析介质。本发明的新型层析介质具有抗体吸附容量大、耐盐性强等特性，pH调节至弱酸性即可实现抗体高效回收，制备过程简便，价格低廉，可以用于抗体分离。

技术领域

本发明涉及一种以苯并噻唑基硫代羧酸为功能配基的层析介质及其制备方法，属于生物化工领域中的蛋白层析分离技术。

背景技术

抗体产品往往纯度要求较高，同时还必须保持生物活性，因此传统的分离过程往往难以满足要求。蛋白A或蛋白G亲和层析介质能够特异性结合抗体，但蛋白类亲和配基易脱落，重复使用次数低，且介质价格昂贵，使用成本极高，限制了规模化应用。传统的离子交换层析和疏水相互作用层析等方法虽然能够结合抗体，但是特异性和选择性较差，分离步骤多，纯化效果有限。因此，开发具有抗体选择性的非蛋白类配基是研发重点。

针对抗体分离的非蛋白配基主要有仿生亲和配基和多肽配基等，这些配基往往过于关注特异性和亲和力，造成抗体洗脱条件较为苛刻或者收率较低。混合模式层析是一种新型的生物分离技术，配基兼有多种功能基团，可以与目标蛋白产生疏水和静电等多种相互作用。混合模式介质的配基密度通常较高，吸附容量大，具有耐盐吸附特性，洗脱条件温和，特别适合于大规模的分离纯化，已在抗体等蛋白的分离纯化中得到应用。混合模式层析的关键是特殊设计的、组合多种相互作用的功能配基。专利CN101402671B、CN101899110B和CN101948535A报道了以巯乙基吡啶、巯甲基咪唑和巯基苯并咪唑为配基的混合模式层析介质从畜禽血液中分离免疫球蛋白，具有步骤简单、分离效率高、成本低廉的特点。专利EP2459308A1报道了以苯并噻唑类化合物作为配基的混合模式层析介质的制备过程，实现多种蛋白的分离纯化。专利US6919436B2和CN1972961B报道了苯并噻唑类化合物作为层析介质的分离配基，偶联到琼脂糖基质，用于血清或血浆等蛋白的分离纯化。Wang等(J.Chromatogr.B,2013,936:33)采用混合模式介质Bestarose Diamond MMA、BestaroseDiamond MMC、MEP HyperCel和PPA HyperCel介质从模拟血清中分离IgG，其中BestaroseDiamond MMA介质同时吸附IgG和HSA，吸附选择性差；Bestarose Diamond MMC和PPAHyperCel介质存在抗体洗脱困难，不利于实际分离应用；MEP HyperCel介质主要吸附IgG，但仍结合少量HSA，IgG的选择性一般。因此，开发性能更优良的混合模式介质，对于抗体的大规模分离纯化有着重要的意义。

针对抗体分离，筛选吡啶类、咪唑类、噻唑类和多芳香环类等小分子化合物配基库，进行了配基和IgG亲和性表征，发现苯并噻唑基硫代羧酸类化合物对IgG亲和性高、耐盐性强，是潜在的抗体分离新型混合模式配基。

发明内容

本发明的目的是提供一种以苯并噻唑基硫代羧酸为功能配基的层析介质及其制备方法。

以苯并噻唑基硫代羧酸为功能配基的层析介质包括层析基质和配基，所述的层析基质为带有羟基的亲水性多孔微球，配基为经烯丙基溴活化后偶联的苯并噻唑基硫代羧酸，所述的苯并噻唑基硫代羧酸为3-(2-苯并噻唑基硫代)丙酸、2-(苯并噻唑基硫代)乙酸或2-(2-苯并噻唑基硫代)丙酸中的一种。

当苯并噻唑基硫代羧酸为3-(2-苯并噻唑基硫代)丙酸时，层析介质的结构组成为：

当苯并噻唑基硫代羧酸为2-(苯并噻唑基硫代)乙酸时，层析介质的结构组成为：