[发明专利]HLA纯合子来源的通用型CAR-T细胞的制备方法

说明书

本发提供了基于HLA纯合子来源的通用型CAR‑T细胞的制备方法。本发明通过收集常见型别纯合子PBMC，构建不同HLA‑A/B型别纯合子PBMC细胞库或诱导生成iPSC细胞库。在此基础上根据病人HLA型别进一步诱导相应PBMC或iPSC到成熟T细胞,并敲除TCR并表达CAR结构，给予这种通用型CAR‑T就可以做到完全克服免疫排斥的问题。本发明在CAR结构中加入了Suicide分子开关元件，保证了临床使用安全性，可以有效的终止细胞因子风暴等不良反应。同时该方案只通过一步CRISPR/Cas9达到插入CAR并沉默TCR的目的，并且省去了敲除MHC‑I类分子的步骤，就能够避免宿主对CAR‑T的排斥，比已有的常规方法步骤更省更方便。

技术领域

本发明涉及免疫学和分子生物学领域，特别涉及CAR-T细胞。

背景技术

目前，美国FDA已经批准了诺华公司两款自体CAR-T细胞产品上市，用于治疗淋巴瘤和白血病。大量的临床试验证明了这种个性化的疗法极具抗癌潜力，没有免疫排斥的风险，安全性也比较高。但在产品上市之后，生产制备时间长，并且足够的细胞仅能用于可变参量(患者体重参差不齐)的单剂量治疗，所导致的高额治疗费用也另很多患者望而却步。因此能够大大缩短产品的开发时间，更具成本效益的同种异体CAR-T细胞(通用CAR-T)疗法便顺应发展趋势，成功在细胞治疗领域掀起了研发热，其中参与布局的不乏Gilead/Kite和辉瑞等全球制药巨头。

当前常见的通用型CAR-T细胞产品基本采用单一敲除TCR的方法，因此不具有对宿主的MHC-I类分子的识别并激活能力，可以避免移植物抗宿主反应(GvHD)，但是通用型CAR-T细胞表面MHC-I分子的表达，会导致其被激活的宿主T细胞清除而影响治疗效果，如果同时敲除TCR和β2M(MHC-I类分子的重要组合蛋白，敲除后MHC-I组装不起来)，但缺少MHC-I分子又会导致通用型CAR-T细胞在体内被宿主NK细胞杀伤。在此基础上又有人企图通过再过表达HLA-E分子，避免通用型CAR-T细胞被宿主NK的杀伤，但是尽管如此也无法完全避免宿主NK的杀伤，并且随着敲除和转化步骤的增多，目的细胞的比例变得越来越低。

目前国内对通用CAR-T的研究与应用尚处于初步阶段，但是我公司计划开发的通用型CAR-T有自己的独特优势，前面列举各个公司的通用型CAR-T产品，虽然排除了抑制物抗宿主反应(GvHD)，但是没有排除宿主抗移植物反应(HvGR)，尽管也能起到一定效果，但是这种CAR-T细胞在体内存活时间短，并且诱导生成的Central memory T细胞比例和数量少。

发明内容

基于当前通用型CAR-T以上种种问题，根据理论及发明人长期研究表明克服免疫排斥最好的情况，是对受体与供体细胞进行HLA配型。发明人研究表明具体到T细胞，当敲除供体T细胞TCR后，可使其不具有移植物抗宿主效应，同时T细胞在正常状态下HLA-DR/DQ等MHC-II类分子不表达，而HLA-A/B两个位点正常表达，并是与急性免疫排斥相关位点。如果供体T细胞HLA-A/B这2个位点是纯合子，宿主无论是纯合子还是杂合子只要带有供体HLA-A/B的单体型就不会对供体细胞产生免疫排斥(HvGR)。因为宿主T细胞经过胸腺的阴选过程，不会具有对相同单体型的细胞产生反应的T细胞。同时给予的通用型CAR-T细胞，由于TCR的敲除也不会对宿主产生排斥反应(GvHD)。结合发明人在人HLA分型领域研究中的长期经验，创造性的提出以下科学设想：虽然经典的MHC-I类分子HLA-A/B/C具有高度多态性，分别有2132、2798、1672种不同基因型别，但是，在特定人群中其分布成特定的比例，特定人群中由于感染性疾病等自然选择，以及婚配都局限在一定的范围，使得大部分人HLA都只是几种常见型别的组合，即使是罕见单体型也常与常见型别呈杂合子形式出现，HLA-A/B两个位点是与急性免疫排斥相关的位点，约20种特定的A/B型别纯合子组合的T细胞敲除TCR后，可以涵盖70％以上的中国人群使用。