[发明专利]一种表达BVDV-E0的重组牛肠道病毒的构建方法与初步应用

说明书

本发明公开了一种表达BVDV‑E⁰的重组牛肠道病毒的构建方法及其初步应用，所述感染性克隆毒株是通过反向遗传操作的方法获得BEV BJ101毒株的全长cDNA克隆并获得拯救毒株rBEV后，将BVDV的E0序列插入到BEV全长cDNA中，获得可稳定表达外源基因E0的重组牛肠道病毒。所述rBEV‑E0重组病毒的初步应用，将分离纯化后的重组病毒免疫6～8周龄的SPF级别的Balb/c雌鼠，在不同时间点收集其血清样本进行检测，小鼠不但可以稳定表达E0蛋白，并能对其产生有效的免疫应答。本发明的重组病毒可同时用于BEV和BVDV的防控，也为其他外源基因提供了合适的的rBEV插入位点，为后续外源基因的插入、重组病毒的制备等研究提供有效的技术平台。

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，涉及一种重组牛肠道病毒，尤其涉及一种表达BVDV-E⁰的重组牛肠道病毒(表达牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)E0蛋白)的构建方法及其初步应用。

背景技术

20世纪50年代首次从牛体内分离到BEV，随后在负鼠、宽吻海豚、骆驼和羊驼等动物体内也分离到该病毒。BEV的病原性不明显，感染宿主后引起腹泻、呼吸困难和繁殖障碍。BEV为单股正链RNA病毒，属于肠病毒属，小RNA病毒科。肠道病毒属共12种型，BEV属于肠道病毒E型或F型。BEV基因组大小约7500bp，基因组包含5’非编码区、ORF、3’非编码，ORF编码结构蛋白(P1区编码的 VP1,VP2,VP3和VP4)、非结构蛋白(P2区编码的2A,2B,2C以及P3区编码的3A,3B,3C和3D)。目前研究表明BEV具有稳定的物理性状、能够抵抗肠道酸性环境、可通过肠道途径进入宿主体内，且该病毒无毒力或毒力较弱。这些特性使BEV成为较好的疫苗候选载体。

牛病毒性腹泻/粘膜病是由牛病毒性腹泻病毒引起的传染病,各种年龄的牛均易感染、以犊牛易感性最高,给我国乃至全球养殖产业带来了严重的经济损失。在BVDV病毒的结构蛋白中,E0蛋白保守性很高,并含有中和表位,产生的中和抗体具有中和BVDV的能力，被认为是BVDV亚单位疫苗的重要靶标抗原。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的就在于提供一种表达BVDV-E⁰的重组牛肠道病毒的构建方法及其初步应用。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：

本发明包括牛肠道病毒，所述牛肠道病毒的感染性克隆毒株是BEV BJ101 株的克隆毒株，具有SEQ ID NO.1所示的全基因序列，其特征在于：所述感染性克隆毒株是通过反向遗传操作的方法获得BEV BJ101毒株的全长cDNA克隆并获得拯救毒株rBEV后，将优化后的牛病毒性腹泻病毒E0序列插入到BEV全长 cDNA中，获得可稳定表达外源基因E0的重组牛肠道病毒，所述E0序列具有如SEQ ID NO.2所示。

具体地，在所述BEV全长cDNA的非结构蛋白2C和3A之间插入优化后的牛病毒性腹泻病毒E0序列。

进一步地，所述牛病毒性腹泻病毒的E0基因的优化包括在构建好的含有 GpBSK-rBEV的质粒的2A和3C基因序列之间插入牛病毒性腹泻病毒的E0基因，对E0的基因序列先进行哺乳动物密码子优化，再在其5’端添加合成GCCGGCCGC NotI酶切位点序列，在其3’端添加合成TCTAGA XbaI酶切位点序列(SEQ ID NO.2所示)，以便于通过NotI、XbaI双酶切后与引入NotI、XbaI双酶切位点的GpBSK-rBEV的质粒进行连接。

具体地，在构建好的含有GpBSK-rBEV的质粒的2C和3A基因序列之间通过重叠PCR的方法引入NotI和XbaI双酶切位点.所述重叠延伸PCR引物包括3 对引物对，分别为：P23-F,P23-2AF和EcoR5-R，从5’端到3’端，引物对的具体序列如下：

P23-F: