[发明专利]一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体及其应用

说明书

本发明提供的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶突变体，其氨基酸序列是在如SEQ ID NO:1所示的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶氨基酸序列基础上，第124位的天冬酰胺替换为精氨酸以及第63位的丝氨酸替换为甘氨酸的氨基酸序列；或者，第105位的缬氨酸替换为丙氨酸、第124位的天冬酰胺替换为精氨酸以及第63位的丝氨酸替换为甘氨酸的氨基酸序列。本发明所述突变体的催化活性得到显著提高，达到野生型的179％或223％，而且温度稳定性也得到了显著改善，突变体在60℃下的半衰期是野生型的1.7倍或3.7倍。对于高温条件下生产D‑阿洛酮糖具有重要意义。

技术领域

本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体涉及一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(DAE)的突变体及其应用。

背景技术

D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(D-allulose 3-epimerase，简称DAE)可以催化多种酮糖C3位的差向异构，是生产稀有糖的良好催化剂，可以果糖为底物生产附加产值高的D-阿洛酮糖。

D-阿洛酮糖是稀有糖家族的重要成员，是一种新型的低能量的甜味剂。因具有较高的甜度和较低的能量，D-阿洛酮糖被认为是一种理想的甜味剂和蔗糖的有效替代品。可帮助制造商减少配方中的蔗糖，用于开发低热量食品饮料。同时，D-阿洛酮糖可以发生美拉德反应，有助于提升食品品质，可以完美替代糖的功能。此外，D-阿洛酮糖还具有独特的生理功能，在临床医学领域具有潜在较大的应用价值。例如治疗肥胖症、糖尿病、高血压、高血脂和动脉粥样硬化等疾病，D-阿洛酮糖还可以通过添加辅料进行喷雾干燥，进而有助于肺部药物给送。2011年美国FDA批准D-阿洛酮糖为GRAS物质，2019年，FDA又宣布将低热量甜味剂D-阿洛酮糖排除在“添加糖”、“总糖”标签之外，因此不需要在这两项类目中计算其添加量，无疑将帮助其在未来进一步扩张市场。D-阿洛酮糖在自然界存在量及其稀少，而且化学法合成困难，所以 D-阿洛酮糖的生物合成法成为了研究的热点

生物法制备D-阿洛酮糖最为有效的方法是寻找能使D-果糖转变为D-阿洛酮糖的酶。然而，目前的DAE 酶对果糖催化活性低，且温度稳定性差等问题不适合工业化生产D-阿洛酮糖。随着D-阿洛酮糖的市场需求量的日益增加，高效的生物催化剂的开发对其工业应用至关重要。因此开发具有高催化活性和温度稳定性好的DAE酶对D-阿洛酮糖的生产有重要的意义。

通过易错PCR获得突变体由于操作简便，有效成为目前应用最为广泛的进化手段之一，其原理是在采用DNA聚合酶进行目的基因扩增时，通过调整反应条件，如提高镁离子浓度、加入锰离子、改变体系中四种的dNTPs浓度或运用低保真度DNA聚合酶等，来改变扩增过程中的突变频率，从而以一定的频率向目的基因中随机引入突变，获得蛋白质分子的随机突变体。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的之一是利用基因工程和蛋白质工程提供一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体。本发明的目的之二是提供表达上述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体的重组载体或宿主菌。本发明的目的之三是提供上述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体的应用，对D-阿洛酮糖的生产有重要的意义。

本发明中采用如下定义：

1、氨基酸残基使用公认IUPAC命名法，用三字母缩写或单字母符号形式。DNA核酸序列采用公认 IUPAC命名法。

2、突变体的标识：采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体中突变的氨基酸。如V105A，表示第105位的氨基酸由亲本D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的谷氨酸Val替换成丙氨酸Ala，位置的编号对应于SEQ ID NO：1中D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的氨基酸序列编号。如 N124R/S63G，表示第124位和第63位的氨基酸都发生了突变。

本发明的技术方案概述如下：