[发明专利]珊瑚菜的内参基因及其筛选方法与应用

说明书

本发明公开了珊瑚菜的内参基因及其筛选方法与应用，属于植物基因工程技术领域。具体涉及珊瑚菜的内参基因及其引物，所述内参基因为PP2A、UBQ10、ACT、EF1‑α、GAPDH、α‑TUB、β‑TUB、PTBP1、EXP1、EXP2、TIP41‑like、SAND family、CYP2；并提供了一种珊瑚菜内参基因的实时荧光定量PCR筛选方法，填补了珊瑚菜研究领域中缺少合适的、通用的内参基因的空白。

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，更具体地说，涉及珊瑚菜的内参基因、及其筛选方法与应用。

背景技术

珊瑚菜，为伞形科草本植物，以根入药，名北沙参，是我国传统中药材，在《神农本草经》中被列为上品，其性味甘淡，微寒，有养阴清肺，益胃生津功效，主治肺热阴虚燥咳，胃燥咽干口渴等症，临床和保健中常用，在国内外市场年需求量可达8000吨以上。

珊瑚菜野生资源主要有两个分布区域：其一为东亚珊瑚菜分布区，其二为北美珊瑚菜分布区，中国是东亚珊瑚菜分布区的主要生长地域之一。在我国，辽宁、江苏、山东、浙江、福建、广东以及海南的沿海海岸，在历史上均为珊瑚菜的道地药材产区，是北沙参商品药材的重要来源地。珊瑚菜生长于原始海滩的沙地中，其根系发达，在生长过程中自然膨大形成根状茎，因此，也是海岸固沙的良好经济品种。目前珊瑚菜的产业研究中面临两个主要问题，问题之一是亟需进行珊瑚菜耐盐机制研究，前期由于沿海开发等原因，上述珊瑚菜的沿海道地产区范围逐渐缩小，甚至消失；所以珊瑚菜的主要产区逐渐向内陆转移，比如内蒙、河北等内陆地区，逐渐成为了珊瑚菜的主要人工种植栽产区，但是，在内陆人工种植栽产区内，珊瑚菜长势受限，且质量参差不齐。虽然近年来，随着我国沿海新围垦土地的开发利用，为珊瑚菜的沿海道地产区规模的恢复提供了空间和机遇，然而现有的珊瑚菜主栽种由于长期由内陆栽培及人工选种，导致耐盐性不足，在沿海盐碱地恢复种植难度极大。问题之二是珊瑚菜药材道地性形成的机制尚未清晰，而其特定的沿海高盐生存环境，或许是影响其药效成分积累和药材道地性形成的重要原因，具体的影响机制有极大研究意义。要解决上述两个问题，不可避免地要对珊瑚菜的耐盐机制、育种、活性成分的合成代谢机理等各个方面进行研究，均需对珊瑚菜进行植物分子生物学领域的研究。

基因表达分析是植物分子生物学领域研究中重要手段之一，其在深入对探寻植物相关基因和调控机理、揭示植物奥妙等方面至关重要。在研究基因表达水平时，需要用到内参基因作为参照，如实时荧光定量PCR(Quantitative real time PCR,qRT-PCR)技术，为获得更加准确可信的结果，都需要内参基因对目标基因的表达水平进行标准化衡量。

在通过qRT-PCR分析基因相对定量表达时，为了消除不同样品初始模板差异、反转录效率差异的影响，需要引入稳定的内参基因对表达结果进行校正。内参基因通常是各种持家基因，在细胞内组成稳定性表达，有助于保持细胞的功能。理想的内参基因应该满足以下条件：1)不存在假基因(Pseudogene)，以避免基因DNA非特异性扩增；2)高度或中度表达，排除低表达；3)稳定表达于不同类型的细胞和组织(如正常细胞和癌细胞)，而且其表达量是近似的，无显著性差别；4)表达水平与细胞周期以及细胞是否活化无关；5)其稳定的表达水平与目标基因相似；6)不受任何内源性或外源性因素的影响，如不受任何实验处理措施的影响。在植物中经常用的如18S rRNA、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、肌动蛋白(Actin)等作为内参基因。然而完美的内参基因几乎不存在，大多内参基因在不同的环境条件、不同的发育阶段和组织器官中表达并不是恒定不变的，只能在一定的试验范围内相对稳定，同时，不同植物有最合适的内参对照基因而同一种植物不同组织之间内参基因的稳定性也存在差异。所以，如果盲目以一种基因作为任何试验条件下的内参基因则直接影响研究结果的可靠程度，甚至产生错误的结果，因此针对特定的试验条件和样品类型选择合适的内参基因进行标准化对于得到准确的基因表达结果至关重要。

而目前，没有关于珊瑚菜内参基因的开发、筛选和稳定性验证方面的研究报道，加之上述原因，对珊瑚菜的稳定内参基因及其引物的开发，在珊瑚菜分子生物学研究、以及伞形科植物的研究中皆具有重要实际应用价值。