[发明专利]一种分离和体外培养人胰腺癌组织类器官的方法

权利要求书

1.一种分离和体外培养人胰腺癌组织类器官的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将人胰腺癌组织剪切后进行酶消化，得到胰腺癌单细胞；其中，酶消化的条件为：37℃，30～40rpm消化10～20min，重复消化3次；

(2)将步骤(1)中得到的胰腺癌单细胞与基质胶混合均匀后，再加入含有生长因子PGE2和胃泌素Gastrin I的培养基进行培养，得到人胰腺癌组织类器官；

步骤(2)中所述的培养基中生长因子PGE2的浓度为1μM，胃泌素Gastrin I的浓度为10nM。

2.根据权利要求1所述的分离和体外培养人胰腺癌组织类器官的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的酶消化通过如下步骤实现：

S₁、将人胰腺癌组织加入到预热的消化液中，37℃，30～40rpm消化10～20min，然后用移液枪或巴氏吸管剧烈吹打消化过的肿瘤组织至少10次，静置，固液分离，得到上清液I和剩余组织II；再将分离得到的上清液I用含BSA的清洗液重悬两次，得到胰腺癌细胞III；

S₂、将步骤S₁中得到的剩余组织II替换步骤S₁中的人胰腺癌组织，重复步骤S₁，得到胰腺癌细胞IV和沉淀V；

S₃、将步骤S₂中得到的沉淀V替换步骤S₁中的人胰腺癌组织，重复步骤S₁，得到胰腺癌细胞VI；

S₄、合并胰腺癌细胞III、IV和VI，加入含BSA的清洗液重悬，再次离心，取沉淀，即为所述的胰腺癌单细胞；

步骤S₁和S₄中所述的含BSA的清洗液中BSA的浓度为质量体积比0.1％。

3.根据权利要求2所述的分离和体外培养人胰腺癌组织类器官的方法，其特征在于：

步骤S₁和S₄中所述的清洗液为Human Wash Medium，其为含有pH 7.2～7.5、10mMHEPES，1×GlutaMAX Supplement，100μg/ml primocin和0.1％(w/v)BSA的Advanced DMEM/F12。

4.根据权利要求2所述的分离和体外培养人胰腺癌组织类器官的方法，其特征在于，在步骤S₄之后还包括裂解红细胞的步骤：若沉淀存在大量红细胞时需要先裂解红细胞；

所述的裂解红细胞为采用ACK buffer进行裂解。

5.根据权利要求1所述的分离和体外培养人胰腺癌组织类器官的方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的酶消化所用的消化液为含有Collagenase II和DNase I的消化液，或含有Collagenase II、Y-27632和DNase I的消化液。

6.根据权利要求1所述的分离和体外培养人胰腺癌组织类器官的方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的培养基中还含有其他生长因子，Wnt激动剂、ROCK抑制剂、BMP抑制剂、激素和非血清添加物；

所述的其他生长因子为hEGF、hFGF和PGE2中的至少一种；

所述的Wnt激动剂为Wnt-3a和R-Spondin1中的至少一种；

所述的ROCK抑制剂为Y-27632和A 83-01中的至少一种；

所述的BMP抑制剂为hNoggin；

所述的非血清添加物为B27、Nicotinamide和N-acetylcsteine中的至少一种。