[发明专利]兰属植物SSR引物，及其在居群遗传多样性分析中的应用

说明书

本发明采用SSR分子标记技术在兰花植物中开发并筛选具有特异性强、多态性高的SSR引物，利用筛选出的引物对采集到的来自9个居群的120株兰花基因组DNA进行检测从而分析其遗传多样性以及居群遗传特性。利用磁珠富集法获得91条具有SSR的DNA序列，并成功设计了72对引物用于多态性引物的筛选，最终筛选出8对扩增稳定、特异性强、多态性高的引物。本发明从分子和形态学层面对兰花的遗传多样性进行分析，揭示兰花遗传分化的主要来源，并对在渝贵川采集的9个野生兰花居群进行聚类分析，以此来说明地理位置对兰花居群遗传分化的影响。

技术领域

本发明涉及分子标记领域，具体地说，涉及兰属植物SSR标记及其应用。

背景技术

SSR也被称为STMS、SSRP，是一种微卫星标记。该技术也是以PCR技术为基础的，因其需要提前知道样本DNA序列，因此根据序列设计出的引物具有非常强的特异性。微卫星侧翼序列保守，通过PCR扩增后，并通过琼脂糖凝胶电泳或者聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物以检测多态性。SSR标记的优点：(1)SSR技术是共显性标记，能够区分杂合子、纯合子，可获得较多信息；(2)多态性高、重复性好、稳定性强。缺点是实验成本高，耗时长，需要大量的人力物力，这也是限制SSR标记发展的一个重要原因。虽然SSR标记技术耗时费力，但因其极高的特异性而广受研究者的欢迎。刘艳丽将SSR分子标记应用到鉴别中草药伪品的研究中，SSR的长度差异以及等位基因数目的变化会显示出伪品与正品之间的差异。徐礼羿等采用SSR标记技术评估了大叶种茶树的遗传多样性以及居群结构，构想了大叶种茶树居群可能的来源。

SSR标记普遍并广泛存在于植物基因组DNA中，因其重复单元的长度、数量等存在多态性，因此可以利用这种特性根据SSR序列两翼的保守序列设计引物，采用PCR技术在植物基因组DNA中扩增出具有多态性的DNA序列片段。SSR标记引物具有特异性，因此必须提前获取所研究植物的基因组序列，利用SSR标记搜索工具找到相对应的SSR标记，才能够设计出成对的具有特异性的SSR引物，因此SSR标记的开发是SSR分子标记技术的难点。由郭大龙对开发SSR标记的方法总结归纳得出：(1)从公共的DNA序列数据库或者已经发表过的文章中获取SSR两翼的保守序列和引物，这种方法最省时省力，也大大缩小了经济成本，但是由于物种基因组信息的缺乏，已获得的序列信息并不能满足SSR引物设计的需求，因此此方法不具有长远性。(2)相同标记实现物种间共用。如在大豆、水稻中获得的专一性SSR引物同样可以应用于柑橘属、芸薹属、猕猴桃属。但目前仍没有确定微卫星引物在不同类群中推广的标准。(3)构建基因文库。此方法技术路线成熟，并且在开发微卫星标记中使用最多的方法。此方法是提前获知基因组信息的前提下与含有SSR的生物素化的探针杂交，检测阳性克隆具体基因序列，根据搜索到的SSR标记的两翼保守序列设计特异性引物。此方法微卫星引物获得的效率低，但是操作简单，易于理解，是开发微卫星引物的经典方法。(4)富集法，即建立微卫星富集文库从而提高阳性克隆的获得率。此方法可分为两种，一种是引物富集法，即利用含有SSR的引物进行微卫星富集；另一种是杂交富集法，即利用含SSR的探针进行微卫星富集。近些年来，采用杂交富集法开发微卫星引物的研究颇多，该方法又分为尼龙膜法和磁珠富集法，尼龙膜法是利用吸附在尼龙膜上的微卫星探针来富集基因组DNA中的微卫星序列，洗脱富集到的片段，进行PCR扩增，连接载体并转入到大肠杆菌，从而挑取阳性克隆进行测序；相比之下，磁珠富集法更受广大研究者的青睐，此方法是先用生物素标记的重复序列的探针与经过酶切后的基因组DNA杂交，因生物素与链霉亲和素有较强的亲和性，因此利用含有链霉亲和素的磁珠与杂交液充分混合，从而利用磁力将含重复序列的目标片段进行富集，从而大大提高了重复序列片段的获得率。富贵等采用磁珠富集法开发微卫星片段，共获得阳性克隆克隆236个，选取其中80个进行测序，其中68条序列为唯一序列，选择40条含有SSR位点的序列成功设计出40对引物，经过筛选，最终获得了20对扩增稳定、多态性高的引物，成功率达到50％。王久利等在开发青藏高原特有珍贵植物西川红景天(Rhodiolaalsia)微卫星标记的研究中利用FIASCO磁珠富集法共获得2500个阳性克隆，随机挑选其中200个阳性克隆进行测序，获得105个含有微卫星位点的序列，并成功设计引物105对，经筛选获得了13对多态性高、稳定性强的引物，并利用这些引物对西川红景天的居群结构进行了进一步研究。(5)省略筛库法，这种方法不需要刻意筛选含SSR的克隆，所获得的SSR在转化成特异性标记时，只需合成一个特异引物，结合已有的锚定引物就可以检测基因组中对应的SSR了。这种方法主要有两种：STMP法和SAM法。这两种方法虽然提高了开发SSR标记的效率，但是操作复杂繁琐。在实际操作过程中如何选择微卫星引物开发方法，需要根据课题的研究方向以及实验室条件来选择。