[发明专利]一种针对COPD患者的原代支气管上皮细胞的分离培养方法

权利要求书

1.一种COPD患者原代支气管上皮细胞的分离培养方法，其特征在于：所述分离培养方法包括如下步骤：

S1、获取组织置于装有PBS缓冲液的培养皿中；

S2、去除多余的结缔组织，解剖呼吸道，切成片段；

S3、准备组织洗涤液清洗三次；

S4、将组织转移到离心管中通过组织消化液I消化并置于4℃摇床上摇晃过夜，组织消化液I的成份为J-MEM、1%链霉蛋白酶以及0.01% 牛胰腺脱氧核糖核酸酶I的混合液；

S5、结束消化，将离心管中的组织倒入组织培养皿中，加入胎牛血清至终浓度为10%，终止消化；

S6、用PBS缓冲液冲洗后收集到离心管中，采用500×g离心力，4℃下离心5min；

S7、加入组织消化液Ⅱ后置于37℃敷箱中，静置，直到视觉上看到组织块分离，组织消化液Ⅱ成份由PBS、EDTA、DTT、蛋白酶XIV、CaCl₂、MgCl₂以及DNase I组成；

S8、加入FBS至终浓度为10%，将溶液转移至离心管中后，将离心管置于离心力500×g，4℃的离心机中离心5min；弃上清，加入DMEM/F12培养基重悬后进行细胞计数；

S9、将离心沉淀的细胞置于含有BEGM培养基的培养皿中培养，24h后换液，后每隔2-3天处理换液以完成分离。

2.如权利要求1所述的一种COPD患者原代支气管上皮细胞的分离培养方法，其特征在于：还包括细胞培养方法，

S10、准备包括用于P0和新鲜冻存的细胞复苏培养时的涂有胶原的培养皿，及传代细胞培养时的未涂胶原的培养皿；

S11、细胞培养：P0细胞：把P0代细胞铺在板上后24h后评定铺板效果，细胞团或漂起来的细胞，用PBS清洗掉，并换上含有抗生素的BEGM；将悬浮的细胞团收到圆锥管里面，以500×g离心力离心5min，重复添加组织消化液Ⅱ进行分离，组织消化液Ⅱ成份由PBS、EDTA、DTT、蛋白酶XIV、CaCl₂、MgCl₂以及DNase I组成；传代的原代细胞：在原代细胞生长到70-90%的时候将细胞进行传代，用最少量的胰酶收获难以分离的细胞，先用PBS将细胞清洗，在培养皿中加胰酶/EDTA，放在37℃下5-10min，轻轻敲打细胞培养皿，添加10%的FBS终止消化后，收集细胞并以4℃、500×g离心力离心5min，弃去上清，用培养基重悬细胞并计数。

3.如权利要求1所述的一种COPD患者原代支气管上皮细胞的分离培养方法，其特征在于：所述BEGM培养基为无血清的BEGM培养基，所述BEGM培养基为在无血清的BEBM培养基按体积比例添加 4% v/v的牛垂体提取物、0.25% 氢化可的松，1%胰岛素，1%的人血管内皮生长因子，1%的肾上腺素，1%的转铁蛋白，1%视黄酸，1%的三碘甲状腺氨酸以及1%的庆大霉素/两性霉素B，并经过经 0.22μm 孔径滤膜过滤。

4.如权利要求2所述的一种COPD患者原代支气管上皮细胞的分离培养方法，其特征在于：所述S11中培养皿中胶原添加时用去离子水1:75稀释，并放在37℃，2-24个小时，弃掉多余的液体，在紫外下放30 min。