[发明专利]一种食管癌细胞系中功能基因敲除后增殖表型的快速鉴定方法及其应用

说明书

本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种食管癌细胞系中功能基因敲除后增殖表型的快速鉴定方法及其应用。本发明通过分别转染目的基因sgRNA与CRISPR/Cas9载体同源重组后的质粒和CRISPR/Cas9的空载，然后利用流式细胞仪分选细胞，接种至六孔板中。余下的细胞裂解获取DNA，PCR后作琼脂糖凝胶鉴定验证。分选的细胞在细胞培养箱中培养2周后，终止培养，以4％多聚甲醛固定后，再经结晶紫染色。此时可肉眼判断每组细胞的克隆形成数目，克隆形成率可准确反映细胞的增殖能力和群体依赖性。根据克隆形成结果即可快速判断食管癌功能基因敲除后的增殖表型，本发明具有高效率、高精确和高通量等优势。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种食管癌细胞系中功能基因敲除后增殖表型的快速鉴定方法及其应用。

背景技术

食管癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，由于其早期症状不明显，大多食管癌患者确诊时已是晚期，预后极差。目前我国食管癌患者5年生存率只有20％左右。尽管形势严峻，然而在肿瘤研究领域，食管癌的基础研究与药物开发却相对滞后，尤其是食管癌在世界范围内地区分布有显著的差异性，而中国是最主要的高发区，其中绝大多数属于鳞癌。因此开发食管癌高通量研究平台，十分必要。

CRISPR/Cas9—基因编辑的魔法剪刀手，作为一种最新涌现的基因组编辑工具，能够完成RNA导向的DNA识别及编辑，使用CRISPR/Cas9系统开发食管癌高通量研究平台比较方便。CRISPR的基因打靶系统，可利用靶点特异性的RNA将Cas9核酸酶带到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行切割，导致基因敲除等等。与传统基因编辑方法相比，CRISPR的打靶系统简单，载体构建简单，打靶效率很高，是细胞系基因敲除模型制作中广泛采用和认可的手段之一。

传统的细胞系敲除，即使采用CRISPR/Cas基因编辑系统，仍需在细胞转染后进行多轮抗性药物筛选以及极限稀释分离出单克隆细胞并扩大培养后方可进行表型分析，无论是极限稀释方法还是抗性筛选方法，筛选到阳性细胞后均需要将单个细胞扩大培养到一定程度后方可进行表型分析，耗费大量时间成本和人力成本；而且筛选效率低下，分析表型费时，很大程度上拖延了食管癌功能基因的研究进度和广度。

公布号为CN109402179A中国发明专利申请中公开了一种细胞系中食管癌功能基因敲除后增殖表型的快速鉴定方法，其中指出RND2基因亦可通过细胞分选后收取不同时间点的DNA进行片段分析，但是该技术路线需要两次提取DNA的过程，并且后续片段分析实验操作繁琐，所需测序仪价格昂贵不易推广。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种食管癌细胞系中功能基因敲除后增殖表型的快速鉴定方法及其应用，该方法能够快速判断食管癌功能基因敲除后的增殖表型，实现食管癌高通量的分子筛选，对食管癌相关基因功能研究具有很强的指导作用。

本发明是这样实现的，一种食管癌细胞系中功能基因敲除后增殖表型的快速鉴定方法，包括以下步骤：

步骤1：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将食管癌细胞功能基因PARK2基因敲除；

步骤2：细胞分选，将功能基因敲除的细胞与空载对照组细胞分别接种至孔板培养；

步骤3：将孔板培养的细胞固定后，经结晶紫染色，目测两组细胞的克隆形成率，判断食管癌功能基因敲除后的增殖表型。

进一步，步骤2中细胞分选后，另取细胞裂解提取DNA，进行PCR、电泳鉴定，验证功能基因是否成功敲除。

进一步，PCR检测的引物序列见SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11。

进一步，步骤2中使用流式细胞分选仪对食管癌功能基因敲除的细胞与空载对照组的细胞进行分选，并接种至六孔板中培养。