[发明专利]检测枯草芽孢杆菌NCD-2菌株的特异性引物及应用

说明书

检测枯草芽孢杆菌NCD‑2菌株的特异性引物及应用。本发明涉及特异性检测枯草芽孢杆菌NCD‑2菌株的引物。本发明所述特异性引物包括上游引物qNCD‑ORF7‑F和下游引物qNCD‑ORF7‑R，qNCD‑ORF7‑F的核苷酸序列为5’‑AGGCAGCATTCAAGCACCAG‑3’，qNCD‑ORF7‑R的核苷酸序列为5’‑AGCCAGCGATCATTCCCATC‑3’，利用所述引物能够从NCD‑2菌株扩增出片段单一的目的片段，但在其他细菌中均没有扩增信号，从而利用所述引物实现了NCD‑2菌株的特异性检测。本发明还提供一种包含本发明引物的用于检测枯草芽孢杆菌NCD‑2菌株的检测试剂盒。本发明所述引物和试剂盒具有特异性高、检测效率高、假阴性率低、保存时间长等特点。

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，尤其涉及一种检测枯草芽孢杆菌NCD-2菌株的特异性引物及应用。

背景技术

枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一种，生长和繁殖速度较快，所形成的芽孢具有耐逆、抗热的优点。另外，枯草芽孢杆菌菌体生长过程中会产生枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些活性物质对植物病原菌有明显的抑制作用。因此，枯草芽孢杆菌成为开发微生物杀菌剂的重要资源。枯草芽孢杆菌通过成功定殖至植物根际、体表或体内，与病原菌竞争植物周围的营养，分泌抗菌物质以抑制病原菌生长，同时诱导植物防御系统抵御病原菌入侵，从而达到防治植物病害的目的。

中国专利文献CN1528885A公开了一种防治棉花黄萎病的菌株及其菌剂的制备方法，其中公开了枯草芽孢杆菌NCD-2菌株能有效地防治棉花黄萎病。以枯草芽孢杆菌NCD-2菌株为主要活性成份的微生物农药目前已经商品化。为加强对NCD-2菌株的保护，以及快速识别NCD-2菌株，建立枯草芽孢杆菌NCD-2 菌株特异性检测技术尤为重要。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于特异性检测枯草芽孢杆菌NCD-2菌株的引物。本发明人通过转座子随机插入突变技术，构建了枯草芽孢杆菌NCD-2菌株的突变子库，筛选获得一株生物膜形成能力降低的突变子。通过巢式PCR技术克隆获得突变子中转座子插入位点基因。通过在NCBI 数据库中进行序列比对，世界范围内没有发现与NCD-2菌株同源性较高的菌株，因此根据NCD-2菌株中该基因片段设计出针对NCD-2菌株的特异性引物。

本发明所述特异性引物包括上游引物qNCD-ORF7-F和下游引物qNCD-ORF7-R，利用该引物可以从NCD-2菌株扩增出片段单一的目的片段，但在其他细菌中均没有扩增信号，实现了NCD-2菌株的特异性检测。

本发明所采用的技术方案为：

一种用于检测枯草芽孢杆菌NCD-2菌株的特异性引物，其特征在于，所述引物包括上游引物qNCD-ORF7-F和下游引物qNCD-ORF7-R；

所述qNCD-ORF7-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示：5’ -AGGCAGCATTCAAGCACCAG-3’；

所述qNCD-ORF7-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示：5’ -AGCCAGCGATCATTCCCATC-3’。

一种用于特异性检测枯草芽孢杆菌NCD-2菌株的试剂盒，其包含DNA裂解液、扩增反应液、引物混合液和阳性对照液，所述引物混合液包括如权利要求1所述的特异性引物。

进一步地，所述DNA裂解液包括100mM NaCl、pH值为8.0的10mM Tris-Cl、pH值为8.0的25mM EDTA、1％W/V的十二烷基硫酸钠和1.7μg/μL 蛋白酶K；所述扩增反应液包括PCR缓冲液、25mM MgCl₂溶液和2.0mM脱氧核糖核苷酸溶液。