[发明专利]一种发酵合成麦角硫因的工程菌株及其构建方法

说明书

本发明公开了一种发酵合成麦角硫因的工程菌株及其构建方法，属于生物工程技术领域。本发明以大肠杆菌和枯草芽孢杆菌为宿主，以枯草芽孢杆菌、大肠杆菌与酿酒酵母的三穿梭质粒pEBS为表达载体，在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌引入不同来源egtABCDE基因簇进行异源表达。实现生物合成麦角硫因。然后对egtABCDE基因簇进行优化表达，包括密码子优化、启动子优化和不同组合表达，同时优化培养基及添加的甲硫氨酸、组氨酸甜菜碱、组氨酸、半胱氨酸，经过优化表达和优化培养条件，实现了高效生物合成麦角硫因。本发明为微生物系统高效发酵制备麦角硫因奠定了基础，适合于工业化生产应用。

技术领域

本发明涉及一种发酵合成麦角硫因的工程菌株及其构建方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

麦角硫因是一种稀有的天然手性组氨酸衍生类硫醇化合物，具有独特的生物学功能和药理活性。它不仅具很强的有抗氧化活性：可以清除经自由基、过氧亚硝基、次氯酸、鳌合二价金属离子、激活抗氧化物酶、抑制超氧化物歧化酶等，而且也具有抗炎作用和保护细胞作用，在医药、食品、保健品和化妆品及生物技术等领域具有广泛的应用前景和市场前景。

麦角硫因在1909年首次从麦角菌中分离得到，在放线菌、蓝细菌和裂殖酵母、部分蕈菌、链霉菌、分枝杆菌等微生物中也能合成，而其他细菌物种如：枯草芽抱杆菌、大肠杆菌、普通变形杆菌与链球菌等不能合成。麦角硫因也不能被动物和植物生物合成，但可被植物和动物吸收与积累，并广泛分布于哺乳动物的细胞和组织中。麦角硫因在人生理学中是至关重要的，人必须从膳食来源中获取，并在在特定组织和细胞诸如肝、肾、中枢神经系统和红细胞中积累。目前可通过化学合成法、提取法以及生物发酵合成法生产麦角硫因。化学方法合成左旋的麦角硫因十分困难，产品的安全性难以保证，合成原料昂贵，合成成本高，未达到预期的产量；提取法生产麦角硫因时也存在很多困难，如原料来源不足、原料中麦角硫因的含量仍然很低且提取成本高、有药物残留等，随着分子生物学及代谢工程等生物科学的快速发展，生物发酵合成法生产麦角硫因成为最具有潜力的生产方法。

然而，现有的报道中，通过构建基因工程菌生产麦角硫因的方法，其效果并不理想。如用来自耻垢分枝杆菌的egt基因在大肠杆菌中进行异源表达。将基因簇中的基因拆分连接到多个质粒中，再将质粒转化进大肠杆菌中，优化表达重组酶来提高麦角硫因产量，尽管如此，摇瓶产量仅有24mg/L(Osawa R,Kamide T,Satoh Y,et al.Heterologous andHigh Production of Ergothioneine in Escherichia coli[J].Journal ofAgriculturalFood Chemistry,2017,66(5):1191-1196.)。

因此，提供一种能够实现高效生物合成麦角硫因的方法，对于工业生产麦角硫因具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种发酵合成麦角硫因的工程菌株，是以大肠杆菌或枯草芽孢杆菌为宿主，异源表达egtABCDE基因簇，或，表达氨基酸序列如k或l所示的蛋白质，所述egtABCDE基因簇的氨基酸序列如e、f、g、h、i或j任一所示。

在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌包括大肠杆菌MG1655，大肠杆菌DH5α，大肠杆菌W3110或大肠杆菌BL21。

在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌168，枯草芽孢杆菌W600或枯草芽孢杆菌W800。

在本发明的一种实施方式中，所述egtABCDE基因簇来源为Mycobacterium aviumsubsp.paratuberculosis str.k10，Mycolicibacter icosiumassiliensis strain 8WA6，Mycobacterium colombiense CECT 3035，Mycobacterium marinum E11，Mycobacteriumsp.KMS或Mycobacteroides salmoniphilum。