[发明专利]利用Gateway技术构建TYLCV和ToCV的双价RNAi表达载体及其应用

说明书

本发明公开了一种利用Gateway技术构建TYLCV和ToCV的双价RNAi表达载体及其应用。其中的双价RNAi表达载体，命名为pRNAi‑TOCV‑TY。所述RNAi表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。本发明利用RNAi技术进行了大量的研究工作，通过Gateway技术，构建了TYLCV和ToCV的外壳蛋白基因双价RNAｉ表达载体，通过遗传转化、抗性鉴定等实验方法获得了抗两种病毒的转基因番茄植株。本发明进一步公开了pRNAi‑TOCV‑TY表达载体在有效防治ToCV和TYLCV的复合侵染番茄方面的应用。特别是pRNAi‑TOCV‑TY表达载体有效阻碍番茄病毒在植株体内的复制方面的应用。

技术领域

本发明提供一种利用Gateway技术快速、简捷地构建抗TYLCV和ToCV病毒双价RNAi表达载体，并用于抑制这两种病毒的侵染，从而培育出双抗的植物新材料。属基因工程技术领域。

背景技术

番茄（ Lycopersicon esculentum Mill.）是我国设施栽培的主要蔬菜作物之一，在蔬菜周年供应上占有重要地位。但随着番茄种植面积的日趋扩大和引种渠道的多样化，番茄病毒病也日益严重，成为制约番茄发展的瓶颈。

目前，番茄褪绿病毒（ Tomato chlorosis virus , ToCV）和番茄黄化曲叶病毒（ Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV）对番茄危害最为严重，且经常出现复合侵染的情况，加重病症，造成产量和质量的严重下降。目前，对番茄黄化曲叶病毒主要是利用野生抗性资源培育抗病品种。而这种方法对番茄褪绿病毒却无能为力，因为到目前为止，在世界范围内还未找到对这一病毒的抗性基因。所以培育抗番茄褪绿病毒已成为亟待解决的难题。

近年来，利用RNAi沉默技术作为一种抵抗外来基因入侵的防御方式成为基因工程抗病育种中的最为有效的一种方法。构建植物RNAi表达载体的方法基本分为两种,一种为以酶切连接为基础的传统的植物RNAi表达载体构建；另一种以同源重组为基础的植物RNAi表达载体构建。以Gateway 为代表的同源重组RNAi表达载体构建方法，以其高效、快捷的特点而广泛得到应用。用该方法培育抗病毒品种的研究也有报道如Kamachi等利用黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）的外壳蛋白基因得到了稳定的抗病株系；颜培强等利用TMV的外壳蛋白基因构建RNAi载体并转化到烟草中，转基因植株表现了良好的抗性。但在番茄上，TYLCV和ToCV经常发生复合感染，必须构建抗两种病毒沉默载体才能培育出多种抗性的番茄材料。

本发明利用Gateway技术，构建TYLCV和ToCV的外壳蛋白基因保守区段的双价RNAi植物表达载体，进一步转化番茄培育抗病毒材料，为番茄的抗病育种提供新资源。

发明内容

番茄黄化曲叶病毒和番茄褪绿病毒经常发生复合侵染的现象。因为番茄褪绿病毒无抗源，所以目前对该病的防治只能是防止烟粉虱的传播，但烟粉虱体积小，抗药性强，在番茄生产上，这种方法很难奏效。针对上述问题，发明人利用RNAi技术进行了大量的研究工作，通过Gateway技术，构建了TYLCV和ToCV的外壳蛋白基因双价RNAi表达载体，通过遗传转化、抗性鉴定等实验方法获得了抗两种病毒的转基因番茄植株。

为实现上述目的，本发明公开了一种利用Gateway技术构建的TYLCV和ToCV双价RNAi表达载体，其命名为pRNAi- TOCV-TY。所述RNAi表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示：

RNAi序列：

atggagaaca gtgctgttgc aaacactggt gataacggtg gtggccgcaa tcctctggtt