[发明专利]一种多基因重组干酪乳酸杆菌、制备方法及应用

说明书

本发明涉及一种多基因重组干酪乳酸杆菌、制备方法及应用，通过T‑A克隆将目的基因分别连入到pMD18‑T，转化至DH5α感受态细胞得到pMD18‑T‑S1、pMD18‑T‑GtxA‑N和pMD18‑T‑flfA，分别以pMD18‑T‑S1、pMD18‑T‑GtxA‑N和pMD18‑T‑flfA为模板进行扩增，得到三条目的片段，将三条目的片段连接为一条片段，PCR扩增pMG36e使其变为线性化载体，通过无缝克隆技术将该片段和线性化载体连接，并将连接产物转化至XL1‑Bule感受态细胞中得到重组质粒，将其电转化入干酪乳酸杆菌中得到重组干酪乳酸杆菌。

技术领域

本发明属于微生物技术领域，特别涉及一种多基因重组干酪乳酸杆菌、制备方法及应用。

背景技术

蛋鸡输卵管囊肿一直是危害养禽业的重要疫病，该病以干酪性输卵管炎、输卵管堵塞为特征，往往导致产蛋高峰期的鸡产蛋量及产蛋质量迅速下降，特别是当年生的高产母鸡更多见。通常认为传染性支气管炎病毒、鸭源鸡杆菌(G.anatis)、减蛋综合征病毒及衣原体等是引起输卵管炎及输卵管囊肿主要病原体，尤其是G.anatis。RTX毒素(Repeats intoxin)存在于多种革兰氏阴性菌中，在对特异性物种的致病过程中起重要作用，GtxA蛋白是鸭源鸡杆菌RTX样毒素，具有白细胞毒性和溶血活性，研究表明GtxA蛋白的N端区域具有良好的免疫原性，并证明重组蛋白GtxA-N可以引发有效的免疫保护可作为防制G.anatis的疫苗抗原。F17样菌毛是G.anatis的重要毒力因子，且可以作为非血清型依赖的保守的潜在疫苗候选蛋白。IBV病毒主要侵害鸡呼吸系统及消化生殖系统，并且有人认为鸡输卵管囊肿的发生与鸡IBV病毒早期感染有关，同时，G.anatis感染的鸡体内往往能分离出IBV病毒、减蛋综合征病毒和支原体等，因此，IBV病毒也是引起蛋鸡输卵管囊肿的重要病原。IBV病毒基因组共编码4种结构蛋白，其中病毒外膜上的纤突(S)蛋白在翻译后需裂解为S1和S2的2个蛋白亚基才能成为有生物学活性的成熟蛋白，Sl蛋白是IBV病毒的主要抗原。

目前，G.anatis和IBV已呈全球性分布，且研究显示二者感染蛋鸡后均会引起输卵管炎和输卵管囊肿，因此，对这两种病的综合防控能在很大程度上减少蛋鸡输卵管囊肿和输卵管炎的发生，有效降低蛋鸡业的经济损失。疫苗免疫是防控疫病的重要手段，研制安全、高效、实用的G.anatis和IBV联合疫苗显得有为重要。疫苗的选择在整个免疫保护过程中非常重要，经黏膜侵入宿主是感染的重要的途径，因此通过黏膜免疫可以有效地抵制病原体的侵入。

为此，需要研制一种可刺激机体黏膜免疫系统产生局部特异性免疫应答，从而引起全身性免疫反应的疫苗，由此对家禽进行免疫保护。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可制备安全、高效、实用的G.anatis和IBV联合疫苗的多基因重组干酪乳酸杆菌。

本发明提供的一种多基因重组干酪乳酸杆菌，由重组质粒pMG36e-S1-GtxA-flfA电转化至干酪乳酸感受态细胞杆菌获得；所述多基因重组干酪乳酸杆菌由重组质粒pMG36e-S1-GtxA-flfA电转化至干酪乳酸感受态细胞杆菌获得；所述重组质粒pMG36e-S1-GtxA-flfA是将融合基因S1-GtxA-flfA连入线型质粒pMG36e的kPnI位点和SalI位点之间得到的，所述融合基因S1-GtxA-flfA的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示。

进一步的，所述干酪乳酸杆菌为Lb.casei CECT5276。

本发明还提供了上述多基因重组干酪乳酸杆菌的制备方法，包括如下步骤：

S1，以IBV Jin-13病毒cDNA为模板，设计特异性扩增引物1，上、下游引物如序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，进行PCR扩增得IBV病毒S1基因片段；扩增片段经胶回收后与pMD18-T载体进行连接，将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，并进行阳性克隆筛选和重组阳性质粒的鉴定，得到重组质粒pMD18-T-S1；