[发明专利]重组干酪乳酸杆菌、重组质粒、疫苗、制备方法及应用

权利要求书

1.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒是由flfA基因片段连入pMD18-T载体的XmaI位点和XbaI位点获得的，所述flfA基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.如权利要求1所述重组质粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，以G.anatis全基因组为模板，设计特异性扩增引物1，上、下游引物如序列表SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：3所示，上游引物添加XmaI的酶切位点及保护性碱基，下游引物添加XbaI酶切位点及保护性碱基，进行PCR扩增，得flfA基因片段；

S2，将S1中flfA基因片段连入pMD18-T载体的XmaI位点和XbaI位点之间，得连接产物；

S3，将S2中连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞并进行阳性克隆筛选，鉴定正确即为构建成功的重组质粒pMD18-T-flfA。

3.一种含权利要求1所述的重组质粒的重组干酪乳酸杆菌。

4.如权利要求3所述重组干酪乳酸杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1，利用XmaI和XbaI限制性内切酶分别对穿梭表达载体pMG36e和重组质粒pMD18-T-flfA进行双酶切，得酶切产物pMG36e酶切片段和flfA酶切片段；

S2，将S1得到的pMG36e酶切片段和flfA酶切片段通过T4连接酶进行连接，得连接产物；

S3，将S2中的连接产物转化至大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞，筛选出阳性克隆即为构建成功的重组质粒pMG36e-flfA；

S4，将S3中建成功的重组质粒pMG36e-flfA电转化至干酪乳酸杆菌感受态细胞得重组干酪乳酸杆菌。

5.一种利用权利要求3所述重组干酪乳酸杆菌制备的疫苗。

6.如权利要求5所述的疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

将重组干酪乳酸杆菌培养至OD₆₀₀＝1.0，4℃，10000rpm，离心10min收集菌体，用无菌PBS洗涤2次，将细菌含量调整至1×10¹⁰CFU/mL。

7.一种如权利要求5所述疫苗在防治鸡输卵管囊肿中的应用。