[发明专利]一种完整糖肽衍生并电荷转移碎裂质谱分析的方法

权利要求书

1.一种完整糖肽衍生并电荷转移碎裂质谱分析的方法，其特征在于，采用N,N-二甲基乙二胺(DMEN)的氨基和酸性氨基酸的羧基间的酰胺化反应，将所述三级胺小分子DMEN引入到完整糖肽上，然后进行分析；其步骤包括：

(1)对蛋白质样品进行还原烷基化反应，打开蛋白质的二硫键；

(2)用胰蛋白酶对样品进行酶解处理，将蛋白质酶解成肽段；

(3)对酶解肽段做二甲基化衍生，保护肽段N端的氨基和侧链的氨基；

(4)对反应后的肽段进行C18SPE除盐，除去多余的反应试剂；

(5)样品进行三级胺小分子N,N-二甲基乙二胺衍生；

(6)用ZIC-HILIC材料富集完整糖肽并除去多余的衍生试剂；

(7)将富集得到的完整糖肽送入LC-MS，采用ETD模式分析。

2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，蛋白质样品浓度为0.5-1.0μg/μL，溶于100mM TEAB溶液中。

3.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，蛋白质样品溶液中DTT的终浓度为10mM，IAA的终浓度为20mM。

4.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，DTT的反应时间为1h,反应温度为56℃；IAA的反应时间为45min，反应避光，反应温度为室温。

5.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，蛋白质样品与胰蛋白酶的质量比为1：50和1:100。

6.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，加入的甲醛溶液(HCHO、DCDO或D¹³CDO)体积分数为4％，氰基硼氢化钠溶液(NaCNBH₃或NaCNBD₃)的浓度为0.60M。

7.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，反应时间为2h，反应温度为37℃。

8.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(4)中，C18-SPE除盐的温度是25-37℃；活化溶液为含0.10％TFA的ACN，平衡溶液为0.10％TFA的H₂O；清洗溶液为0.10％TFA的H₂O；洗脱溶液为0.10％TFA的H₂O/ACN(60/40，v/v)，和0.10％TFA的H₂O/ACN(40/60，v/v)。

9.按权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的步骤(4)中，对二甲基化后的样品进行C18SPE除盐，步骤如下：

①用1mL含0.10％三氟乙酸(TFA)的ACN活化C18除盐柱；

②用1mL含0.10％TFA的超纯水平衡C18除盐柱；

③上样，将经二甲基化标记的酶解肽段加入C18SPE除盐柱，使其在重力作用下通过C18固定相；收集上样液，重复上样一次；

④用3mL含0.10％TFA的超纯水清洗C18除盐柱，除去盐等杂质；

⑤用300L含0.10％TFA的H₂O/ACN(60/40，v/v)洗脱液洗脱肽段，收集溶液；

⑥用300L含0.10％TFA的H₂O/ACN(40/60，v/v)洗脱液洗脱肽段，合并两次洗脱液；

⑦将收集到的洗脱液冻干，进行下一步酰胺化反应。

10.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(5)中，样品需冻干，保持无水状态。

11.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(5)中，采用DMSO重溶样品。

12.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(5)中，DMEN的浓度为5M,PyAOP的浓度为400mM。