[发明专利]分泌表达IL15RA-IL15融合蛋白、CCL21趋化因子的嵌合抗原受体-T细胞及应用

说明书

本发明公开了一种分泌表达IL15RA‑IL15融合蛋白、CCL21趋化因子的嵌合抗原受体‑T细胞及应用。超级IL15能够促进T(尤其是记忆T)、NK、NKT细胞的活化和增殖，CCL‑21可以募集外周CCR7阳性的初始T细胞、记忆T细胞和DC(树突状细胞)进入淋巴组织或肿瘤病灶，进而激活机体内在的主动抗肿瘤免疫反应(如癌症记忆T细胞)，从而显著提高有效率和缓解率、降低治疗缓解后的复发率。

技术领域

本发明属于生物技术工程领域，具体涉及到第四代嵌合抗原受体(CAR)-T细胞(分泌表达IL15Rα(sushi domain)-IL15(N72D)融合蛋白和CCL21趋化因子)的构建与应用(主要以针对B细胞恶性肿瘤为例)。

背景技术

CAR-T疗法是一种以嵌合型抗原受体(CAR)为基础的细胞免疫疗法。通过体外基因转移技术，将编码嵌合抗原受体(CAR)的基因序列转导入T细胞中，生成可以结合靶抗原的肿瘤特异性T细胞。第四代CAR-T细胞通过完备的第一(肿瘤相关抗原)、第二(协同共刺激因子)和第三信号(如IL-7和CCL19)，能显著改善肿瘤病灶免疫抑制微环境，进而激活机体内在的主动抗肿瘤免疫反应，在多种实体瘤小鼠模型中实现了肿瘤完全消除。

近年来，靶向CD19的第二代CAR-T细胞治疗难治/复发性B细胞恶性肿瘤已在美国用于临床，其中急性B淋巴母细胞白血病完全缓解率70％以上、B细胞型非霍奇金淋巴瘤完全缓解率40％以上。但CAR-T疗法10-20％初治无效、30-50％完全缓解后一年内复发，且对实体瘤疗效不佳，主要原因是CAR-T细胞在体内持续时间短、免疫逃逸、肿瘤病灶免疫抑制微环境等。

发明内容

为解决上述背景技术中的问题和缺陷，本发明针对CAR-T疗法初始治疗无效、易复发等难题，发明了一种分泌表达IL15RA-IL15(N72D)融合蛋白、CCL21趋化因子的嵌合抗原受体-T细胞(以靶向CD19的第四代CAR-T为例)，从而显著提高有效率和缓解率、降低复发率。

通过基因工程技术构建plenti-CD19-IL15Rα(sushi domain)-IL15-CCL21质粒载体，然后利用高滴度，高纯度的慢病毒规模化生产工艺包装出慢病毒载体以转导T细胞，培养五天后通过流式分别检测anti-CD19 CAR的表达率，体外验证CAR-T细胞对表达CD19阳性细胞的体外杀伤作用。

编码的第四代嵌合抗原受体，包括作为第一信号的抗原结合结构域、跨膜结构域和作为第二信号的细胞内传导结构域，以及作为第三信号的IL15RA-IL15融合蛋白和CCL21趋化因子，所述的IL15RA-IL15融合蛋白由SEQ ID NO.1所示用于编码IL15RA的核苷酸序列、SEQ ID NO.2所示用于编码连接块的核苷酸序列以及SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列共同编码形成，所述的CCL21趋化因子由SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列编码得到。

本申请所述的SEQ ID NO.1核苷酸序列是基于人源IL15RA；SEQ ID NO.3核苷酸序列为基于人源IL15的成熟体72位氨基酸N-D突变。

与现有技术相比，本发明涉及如下优点：

1.本发明中的第四代CAR-T细胞分泌IL15Rα(sushi domain)-IL15(N72D)融合蛋白(见SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3的核苷酸序列编码，或SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.8氨基酸序列)，该超级IL15促进T(尤其是记忆T)、NK、NKT细胞的活化和增殖。

2.本发明中的第四代CAR-T细胞分泌CCL21(见SEQ ID NO.5核苷酸序列编码，或SEQ ID NO.10氨基酸序列)，能募集外周CCR7阳性的初始T细胞、记忆T细胞、以及DC进入淋巴组织或肿瘤病灶，进而激活机体内在的主动抗肿瘤免疫反应。