[发明专利]一种利用流式细胞仪检测单细胞RNA表达的单细胞基因表达分析方法

说明书

本发明公开了一种利用流式细胞仪检测单细胞RNA表达的单细胞基因表达分析方法，使锁式探针或者双连接探针进入悬浮的细胞中识别并杂交到其目标RNA上的靶序列，通过连接酶将探针连接成环后经过滚环扩增得到滚环扩增产物；未杂交连接的探针无法成环，因此没有扩增产物；滚环扩增产物与荧光标记的检测探针杂交，多余的检测探针通过离心洗涤除去；制备好的样品可以通过流式细胞仪进行荧光信号测定，根据测定荧光信号强度判定目标RNA在单细胞中的表达情况。本发明高度整合了核酸技术、滚环扩增技术和流式细胞术，实现对单细胞RNA表达在流式细胞仪上进行检测分析。

技术领域

本发明属于RNA表达检测技术领域，具体涉及一种利用流式细胞仪检测单细胞RNA表达的单细胞基因表达分析方法。

背景技术

流式细胞技术是利用流式细胞仪进行的一种单细胞定量分析和分选技术。常规的流式细胞术主要用来对单细胞上的蛋白分子表达进行定量分析，其主要原理是基于抗原抗体的特异性结合，通过测定标记抗体的荧光信号来检测细胞蛋白表达水平。通过将光谱上有区别的不同的荧光染料标记到特异的抗体上，可以同时对不同的目标蛋白进行检测。根据免疫学的方法，可以使用直接法或者间接法进行检测：前者是在不同蛋白质的对应特异抗体上标记不同的荧光染料，后者则是在不同物种来源的抗特异抗体的抗体上标记荧光染料。一般来说，直接标记能够实现更多重的检测。目前，流式细胞术已经从单色或者双色检测发展到现在的十色甚至更多色检测。通过多色检测对不同的目标蛋白质进行分析，能够实现更准确的对不同的细胞亚群进行识别、分选以及功能评价等。流式细胞术不仅能够对细胞膜上的蛋白质分子进行检测，也可以对细胞内的蛋白质进行检测。对细胞膜上的蛋白质分子进行检测分析即为细胞膜免疫表型特征分析，常常用于细胞类型鉴定和分选。然而，并非所有的细胞特征蛋白都表达于细胞膜上，因此后期出现了针对细胞内蛋白进行检测的流式细胞分析术，并且成为了细胞分型和筛选的另外一项重要依据。

通过上述可知，传统的流式细胞术主要基于蛋白质检测来对细胞进行分析、分选。随着基因组学研究的不断深入，本领域普通技术人员已经知道基因组中大部分的序列并不编码蛋白质产物，并有一部分基因表达产物为具有生物学功能的非编码RNA。因此很有必要对基因的表达产物RNA进行分析。近年来，随着技术的发展，已经出现了利用流式细胞仪来检测RNA的技术。比如，Thermo Fisher公司突出的PrimeFlow^TM是一种基于bDNA专利技术的流式细胞仪RNA检测技术。其原理是利用一对相互靠近的“Z”型基因特异性寡核苷酸靶标探针组结合靶标RNA序列，之后信号预放大探针和多个放大探针分子先后与靶标RNA结合，进行信号扩增，最后结合上荧光染料的标记探针，通过流式细胞仪可以检测到多达4种RNA靶标。FISH-Flow技术则是一种基于单分子荧光原位杂交(smFISH)的流式细胞仪RNA检测技术，该技术的原理是在靶标RNA上同时结合约50个荧光标记的靶标特异探针，当这些探针聚集在同一个靶标RNA分子上面的时候，能够产生信号放大的作用，其余未被结合的探针通过离心洗涤去除，最后通过流式细胞仪检测结合到RNA分子上的荧光信号实现对靶标RNA表达的检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用流式细胞仪检测单细胞RNA表达的单细胞基因表达分析方法。

本发明的技术方案如下：

一种利用流式细胞仪检测单细胞RNA表达的单细胞基因表达分析方法，包括如下步骤：

(1)根据目标RNA上的靶序列设计锁式探针或双连接探针及其相应的滚环扩增引物和检测探针，该检测探针标记有可被流式细胞仪检测的基团；

(2)将待测细胞经培养后制成单细胞悬液，在该单细胞悬液中加入固定剂，使待测细胞中的RNA分子得到固定；