[发明专利]一种粗糙脉胞菌工程菌及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种粗糙脉胞菌工程菌及其制备方法和应用，其解决了解决现有菌株不能快速降解植物的细胞壁的技术问题，其分类命名为粗糙脉胞菌(Neurospora crassa)Pcbh‑2‑clr2，其保藏编号为：CGMCC No.18102。本发明同时提供了其制备方法和应用。本发明可广泛应用于枝杆发酵领域。

技术领域

本发明涉及一种工程菌及其制备方法和应用，具体地说，涉及一种粗糙脉胞菌工程菌及其制备方法和应用。

背景技术

随着我国农业水平的高速发展，剪枝秸秆等农林废弃物越来越成为我国农业亟待解决的难题。传统的焚烧秸秆的处理方式不仅对土壤没有改良作用，并且还会释放大量有毒有害气体，严重增加空气中PM2.5等污染物的含量。此外，在倡导绿色经济发展的大形势下，焚烧秸秆会急剧增加温室气体的排放，加剧全球变暖的效应。在发达国家中，剪枝秸秆废弃主要以粉碎化为主，粉碎后的秸秆可用于制作堆肥或通过地表覆盖以改良土壤等。在中国，土壤板结化、有机质缺失已经严重危害到农业的发展与土地的可持续利用，所以将简直秸秆作为堆肥原料明显是在中国现阶段最好的办法。然而，在过去的堆肥发酵过程中从粉碎到完熟彻底所需的时间为120-180天。秸秆剪枝堆肥开发过程中，如若发酵不彻底将严重影响土壤中作物的种植。因此，有效缩短堆肥发酵的时间是世界关注的热点。秸秆剪枝发酵过程中，前期如何快速降解植物的细胞壁(纤维素、半纤维素和木质素等)，尽快使微生物与植物内部纤维素半纤维素与木质素接触是加快完熟过程最有效办法，但是目前所用的菌株及降解方法均不能有效解决这一问题。

发明内容

本发明就是为了解决现有菌株不能快速降解植物的细胞壁的技术问题，提供一种可快速降解植物的细胞壁的工程菌株及其制备方法。

为达到上述目的，本发明提供一种粗糙脉胞菌工程菌，其分类命名为粗糙脉胞菌(Neurospora crassa)Pcbh-2-clr2，所述菌株于2019年6月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；其保藏编号为：CGMCC No.18102。

优选的，所述粗糙脉胞菌工程菌含有纤维素水解酶启动子，所述纤维素水解酶启动子的核苷酸序列如序列表的序列1所示。

优选的，所述粗糙脉胞菌工程菌含有纤维素水解酶启动子，所述纤维素水解酶启动子的氨基酸序列如序列表的序列2所示。

本发明同时提供一种粗糙脉胞菌工程菌的制备方法，其包括如下步骤：(1)分别提取粗糙脉胞菌(Neurospora crassa)FGSC 4200的基因组DNA和总RNA，以基因组DNA为模板，扩增启动子序列Pcbh-2；利用总RNA反转录成cDNA,并以cDNA为模板，扩增目的片段clr-2；(2)将上述步骤(1)获得的PCR产物用进行DNA纯化，与用EcoRI和XbaI酶切的pPICZa-A载体用Infusion酶进行连接，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，获得重组菌，提取重组菌的质粒测序验证，测序分析，将该质粒命名为pPICZa-clr2；(3)以pPICZa-clr2为模板，扩增带c-myc标签的clr-2-myc序列；同时以pMF272质粒为模板，扩增pMF272-backbone质粒骨架；将启动子序列Pcbh-2,调控基因序列clr-2-myc和pMF272-backbone混合，利用infusion酶进行连接，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，获得重组菌，提取重组菌的质粒测序验证，测序分析，将该质粒命名为pMF272-Pcbh-2-clr-2；(4)构建正反馈调节菌株：将pMF272-Pcbh-2-clr-2用限制性内切酶DraI进行酶切，纯化回收后，取DNA加入到N.crassaFGSC9717孢子悬液中，进行电击转化，将转化产物在Vogel’s果糖平板培养基上培养，挑取转化子进行菌落PCR验证；将正确的转化子与N.crassa FGSC4200进行交配实验，获得纯合子正反馈调节菌株。

本发明还提供一种粗糙脉胞菌工程菌菌株在枝杆降解中的应用。