[发明专利]一种EV-D68型假病毒及其包装方法

权利要求书

1.一种用于包装EV-D68型假病毒的表达子质粒，其特征在于：所述EV-D68型假病毒的表达子质粒命名为D68-EGFP-CAPSID质粒，所述重组表达质粒具有序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的重组表达质粒，其特征在于：所述重组质粒使用绿色荧光蛋白报告基因(EGFP基因)，所述质粒含有D68病毒结构蛋白基因(P1基因)；所述EGFP基因和P1基因之间插入2A蛋白酶切割位点(-NIVTT-)。

3.根据权利要求1所述的重组表达质粒的构建方法，其特征在于：包含以下步骤：1)绿色荧光蛋白的基因序列与D68所有结构蛋白的基因序列拼接；2)并将2A蛋白酶的酶切位点插入之间；3)设计引物；

所述引物序列为：

D68-EGFP-F gggagACCCAAGCTGGCTAg

D68-EGFP-R CTAGTAACTTGAGCCCCCATaagggtagtaatggccttgtaCAGc

D68-P1-F acaaggccattactacccttATGGGGGCTCAAGTTACTAGACAAC

D68-P1-R tgatggtgatgatgaccggtttaATTGGTCACTAACCTGATATCATGAGGc。

4.一种用于包装EV-D68型假病毒的复制子质粒，其特征在于，所述EV-D68型假病毒的复制子质粒命名为D68-LUC-REPLICON质粒，所述复制子质粒具有序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

5.根据权利要求4所述的一种复制子质粒，其特征在于：所述质粒含有D68病毒5’UTR,P2-P3-3’UTR基因和萤火虫荧光素酶报告基因(Luciferase)基因。

6.根据权利要求4所述的一种复制子质粒，其特征在于：所述质粒萤火虫荧光素酶报告基因(Luciferase)基因与P2-P3-3’UTR基因之间插入2A蛋白酶切割位点(-NIVTT-)。

7.根据权利要求4所述的复制子质粒的构建方法，其特征在于：包含以下步骤：1)扩增获得5’UTR基因，Luciferase基因，P2-P3-3’UTR基因；2)并将2A蛋白酶的酶切位点插入Luciferase基因和P2-P3-3’UTR基因之间；3)将以上三个基因片段进行无缝连接；4)设计引物；

所述引物序列为：

D68-5UTR-F cgtcttcaagaattgcggccgcgtaatacgactcactataggTTAAAACAGCCTTGGGGTTGTTCC

D68-5UTR-R atgtttttggcgtcttccatCTTTGTGAACAGGTTTAGAATCTTCAAAA

D68-LUC-F GTTCACAAAGatggaagacgccaaaaacataaagaaag

D68-LUC-R ccATTGGTCACTAACCTGATcaatttggactttccgcccttc

D68-2A-3UTR-F gaaagtccaaattgATCAGGTTAGTGACCAATGGC

D68-2A-3UTR-R tcaaacatgagaattgtcgacTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT

Overlap-F cgtcttcaagaattgcggcc

Overlap-R tcaaacatgagaattgtcgacTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT。

8.一种EV-D68型假病毒，其特征在于：由所述D68-EGFP-CAPSID质粒表达的D68结构蛋白和所述D68-LUC-REPLICON复制子转录的D68亚基因组RNA组装而成。

9.一种权利要求8所述假病毒的包装方法，其特征在于：是由D68-EGFP-CAPSID、D68-LUC-REPLICON和pcDNA-T7-polymerase共转染293T细胞，而后收获假病毒。