[发明专利]一种大麦小孢子的取材方法

说明书

一种大麦小孢子的取材方法，包括：1)幼穗取材及预处理；2)收集、纯化小孢子。本发明在幼穗取材时，通过控制旗叶与倒二叶叶舌的间距为1.1‑2.0cm，缩小小孢子培养中的诱导分化差异，分离获得的小孢子经培养后诱导成胚率高，分化绿苗能力强，小孢子培养再生的效率提高了3倍，大大降低了小孢子培养中对人工及设备的要求，且能做到量化取材标准，可以提高取材的效率和标准的实用性。

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种大麦小孢子的取材方法。

背景技术

小孢子具有单细胞和单倍体的特性，是细胞工程遗传育种、遗传转化的理想受体，也是研究胚胎发生机理的理想对象。游离小孢子培养是获得纯合加倍单倍体的有效途径，游离小孢子培养技术是目前研究的热点之一，要使游离小孢子培养能够顺利进行，取材至关重要。

大麦小孢子培养取材多采用镜检方法，对取得的幼穗剥离，挑取花药，捣碎，在显微镜下镜检，观察小孢子的发育时期来确定合适的取材时期，选择最适宜启动小孢子离体胚胎发育的时期来达到高效培养再生的目的。

但是，小孢子发育是连续的、复杂的，存在多态性，需要用合适发育时期的比例来定，而对于小孢子发育时期比例的判定标准还存在难度和差异。

前期研究有报道根据花药颜色来决定取材时期，但对于花药颜色的辨别也会因人而异，且对取材人的技术要求较高，不能够推广应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种大麦小孢子的取材方法，确定合适的取材旗叶间距，分离获得的小孢子经培养后愈伤组织产量增加30％左右，获得的愈伤组织易诱导成胚，分化绿苗能力强，再生效率提高了3倍，缩小小孢子培养中的诱导分化差异，提高大麦小孢子培养中的取材效率及取材标准的实用性，提高生产效益。

为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种大麦小孢子的取材方法，包括如下步骤：

1)幼穗取材及预处理

取旗叶与倒二叶叶舌的间距为1.1-2.0cm的大麦幼穗，保留幼穗上部两片叶子下的基部1.0-1.5cm，置于2-10℃环境中低温预处理10-30天；

2)收集、纯化小孢子

对幼穗进行消毒，将花苞接种至试管中，添加10-15ml提取液，旋切，过滤；滤液以400-1000r·min^-1速度，离心3-7min，重复1-4次，收集小孢子；

收集到的小孢子用提取液于23-28℃，黑暗中预处理1-3天后，再用20-22％麦芽糖纯化，将死活细胞分开，收集活的小孢子；

其中，所述的提取液中含有甘露醇50-70g·L^-1，添加CaCl₂ 0.8-1.5g·L^-1、N-吗啡乙烷磺酸0.8-1.1g·L^-1和秋水仙碱5-25mg·L^-1，pH 5.6-6.0。

优选地，所述步骤1)中，将选取的幼穗置于2-5℃环境中低温预处理。

又，所述步骤1)中，将选取的幼穗低温预处理21-30天。

进一步，步骤2)中，将花苞接种至提取液中后放置于0-5℃处理1-2天后再旋切。

又，步骤2)中，将收集到的小孢子用提取液于23-25℃、黑暗中预处理2天。

优选地，步骤2)中，所述麦芽糖的浓度为21％。