[发明专利]一种用于日本血吸虫检测的核酸诊断试剂盒及其检测方法

说明书

本发明提供一种用于日本血吸虫检测的核酸诊断试剂盒，所述的试剂盒提供了一组敏感性高和特异性强的日本血吸虫检测用引物，其引物核苷酸序列为SEQ ID NO.1‑2所示，本发明构建了敏感性高和特异性强的日本血吸虫游离核酸的实时荧光定量的PCR检测技术，可准确快速的检测日本血吸虫的感染，判断水体是否含有毛蚴、尾蚴以及进行血吸虫的虫种鉴定。

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及日本血吸虫核酸特异性基因G01的Real-time PCR的检测方法的建立，及其在检测日本血吸虫游离核酸中的应用。

背景技术

日本血吸虫属于吸虫纲，复殖亚纲，复殖目，裂体科，裂体属(我国兽医系统称为分体属)。日本血吸虫的终末宿主包括人、水牛、黄牛、山羊、绵羊、猪、马、骡和狗等40余种哺乳动物。其中水牛、黄牛、山羊和绵羊等患病家畜是日本血吸虫的主要传染源。目前，在全球74个国家和地区中，约有2亿血吸虫病感染者，其中1.2亿人表现出血吸虫病的临床症状，2千万人患病严重，有6亿人口受血吸虫病感染威胁。血吸虫病仍是一个需要重视的公共卫生问题，被世界银行(World Bank)、世界卫生组织(WHO)和联合国热带病研究发展特别规划署(TDR)列为重点研究、检测、防控的六大热带病之一。日本血吸虫能够逃避宿主的免疫攻击，在宿主的血管中存活长达十几年甚至更长时间，血吸虫感染能引起人和家畜的消瘦，重度感染可以造成人和家畜极高的发病率和死亡率，因此对日本血吸虫检测的研究具有十分重要的临床意义，并能提高疫区畜牧业的经济效益。

日本血吸虫的生活史包括虫卵(eggs)、毛蚴(miracidia)、母胞蚴(primarysporocysts)、子胞蚴(daughter sporocysts)、尾蚴(cercariae)、童虫(schistosomulae)、成虫(adult)7个发育阶段。血吸虫的感染始于人及多种哺乳动物的皮肤接触有尾蚴的疫水，尾蚴侵入皮肤后，尾部脱落转变成童虫，随后侵入末稍血管或淋巴管内，随血流最终汇集于肝门静脉，在肝内合抱并发育，然后下行寄居于肠系膜静脉为成虫，成虫的寿命可达几十年。自尾蚴感染4到6周，雌虫开始产卵，直至虫体死亡。

近年来，药物治疗已经在血吸虫病流行的国家大规模使用。这导致血吸虫感染强度降低，因此血清学和Kato-Katz粪便涂片等常用诊断方法的漏检率上升，诊断价值有所降低。日本血吸虫病在中国的感染率和感染强度显着下降，因此迫切需要更敏感和准确的检测方法进一步防控血吸虫病。目前，日本血吸虫的诊断主要分为病原学诊断和免疫学诊断。病原学诊断是该疾病诊断的金标准，但它需要很长时间并且检出率较低。病原学逐渐被免疫学诊断所取代，但免疫学诊断本身也存在一些缺点，例如难以区分现症感染或既往感染，并且易于发生交叉反应。核酸诊断具有灵敏度高，特异性强的特点，具有血吸虫病早期诊断、鉴别诊断及疗效考核的潜力。目前，核酸诊断方法已广泛用于胎儿诊断，肿瘤诊断等，其敏感性和特异性已得到认可。因此，日本血吸虫病的核酸诊断方法具有广阔的应用前景和潜力。

游离核酸最早于1977年被发现，Leon等学者在对肿瘤患者的研究中发现，它是存在于宿主体内的一种无细胞状态的胞外DNA，主要存在于宿主血液、唾沫、尿液等地方。游离核酸的存在形式主要有：游离DNA(单链DNA、双链DNA或两者的混合物)和DNA-蛋白质复合物。游离核酸的产生机制尚不明确，目前主要有两种观点：一种观点认为游离核酸是机体细胞凋亡或坏死后，释放出的DNA片段。另一种观点认为循环DNA是由细胞本身主动释放的。由于日本血吸虫侵入宿主后，进入宿主的血液循环系统，最终寄生在宿主肝门静脉处，虫体正常细胞凋亡、或虫体死亡后所释放的核酸片段最终会进入宿主血液循环内，这就为日本血吸虫病的核酸诊断提供了理论依据。