[发明专利]一步法检测氟虫腈残留的VHH-ELISA试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一步法检测氟虫腈残留的VHH‑ELISA试剂盒及其应用，所述试剂盒包括盒体、设在盒体内的酶标板以及试剂；其中，酶标板的每个孔包被有氟虫腈包被抗原，所述试剂包括抗氟虫腈VHH‑AP基因工程抗体、氟虫腈标准溶液、缓冲液PBS、洗涤液PBST、显色液和反应终止液等。检测过程中，酶标板孔壁上吸附的包被抗原和待测氟虫腈相互竞争与抗体反应，通过显色反应观察结果。本发明的优点是能准确灵敏地检测鸡肉、鸡蛋中氟虫腈残留，样品的前处理过程简单，耗时少，能同时检测大量的样品，样品检测成本远低于传统的仪器检测方法。与传统ELISA试剂盒相比，样品检测所需时间大大缩短。

技术领域

本发明涉及基因工程以及ELISA检测技术领域，具体地说，涉及一步法检测氟虫腈残留的ELISA试剂盒及其应用。

背景技术

氟虫腈(Fipronil，化学结构式如图1所示)又名芬普尼、锐劲特、非泼罗尼，是一种应用较为广泛的带有三氟甲基磺酰基团的N-苯基吡唑类杀虫剂，对危害粮、棉、油、果蔬、茶叶等主要农作物的害虫都有良好的防治效果。在农药的使用过程中，很多害虫对机磷农药、氨基甲酸酯类农药和拟除虫菊酯类杀虫剂产生抗性。对于此类抗性昆虫，氟虫腈亦有较好的效果。氟虫腈对水产、蜜蜂、家蚕、啮齿类动物、鸟类均有毒性较大，对哺乳动物的毒性中等，氟虫腈会损害人类β3GABAA受体亚单位导致人类神经发育障碍，如自闭症、安格尔曼综合征、癫痫等。由于氟虫腈常用于宠物身上，在人类和宠物接触的过程中同样存在风险。由于在有毒环境中的暴露，有可能会儿童和胎儿的大脑和神经系统发育。

在甲胺磷、对硫磷等高毒有机磷杀虫剂被限制或禁止使用之后，自2009年起，农业部规定氟虫腈除作为卫生及种子包衣剂等，限制田间使用。虽然氟虫腈已经被限用，但仍有违规现象发生。一些农药销售公司将氟虫腈用于农作物的使用宣传，或将其非法添加于其他农药已达到良好的防虫效果。由于氟虫腈半衰期较长、易残留，环境和食品中残留超标问题逐渐引起关注。因此，加强氟虫腈残留的检测，对于科学合理地使用氟虫腈，保障食品安全和人类健康，减少环境污染，增强我国农副产品的国际竞争力，保持我国农业的可持续发展等具有重要意义。

目前已报道的氟虫腈残留检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)和色谱-质谱联用(GC/LC-MS)。运用这些方法需要专业化的实验室、专用仪器设备及专业操作人员，样品前处理复杂，分析成本高，难以满足大量样本现场快速监测的需要。20世纪90年代以来，快速发展的免疫分析技术已被应用于农药残留分析和环境监测，具有简便快速、廉价高效、特异性强、灵敏度高等优点。

基于常规抗体显色原理(HRP酶标二抗显色、2M硫酸终止反应)的氟虫腈残留酶联免疫吸附分析方法，添加待测样品和标准品反应30～60min后，还需添加酶标二抗反应30～60min，步骤较多、耗时较长,且由于受到酶标二抗特异性和灵敏度的影响，具有稳定性相对较低的缺点。本发明以抗氟虫腈VHH-AP基因工程抗体为基础，采用一步法酶联免疫吸附分析方法，无需酶标二抗，添加样品和和标准品反应30～60min后即可直接显色。其检测效率、热稳定性均优于常规抗体显色原理的酶联免疫分析方法。

发明内容

本发明的目的在于针对目前农药残留仪器分析方法成本高、前处理复杂、特异性差、灵敏度低和难以实验现场检测等不足，提供一种具有高特异性、高灵敏度、高准确度、高精确度、操作方法简单，并能用于大批量样品快速检测的，一步法检测氟虫腈残留的ELISA试剂盒。适用于鸡肉、鸡蛋等样品中氟虫腈残留的快速测定。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种抗氟虫腈VHH-AP基因工程抗体，其抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。例如，将SEQ ID NO:4所示序列去掉末端6个组氨酸标签后的氨基酸序列。