[发明专利]一种针对巯基多肽生物样本的前处理方法以及对该生物样本的检测方法

说明书

本发明公开了一种针对巯基多肽生物样本的前处理方法。该方法包括将巯基多肽进行烷基化，同时还对血样进行SSA蛋白沉淀。前处理无需预先分离血浆/血清，在采集血样后室温条件下即可完成反应，可及时锁定巯基多肽的真实水平。巯基多肽经过烷基化后，能够大大提高质谱的离子化效率，从而提升检测的灵敏度，另外还可以提高巯基多肽的稳定性，避免受到其他氧化剂的影响。血样经过SSA蛋白沉淀后，杂质残留少，干扰少，色谱峰型好。使用同位素内标法定量巯基多肽，可以降低基质效应和人为操作误差带来的影响，结果更准确。质谱检测方法准确度和精密度更高。本发明还公开了一种对前处理后的巯基多肽生物样本的检测方法。

技术领域

本发明涉及仪器分析质谱检测领域，特别是涉及一种生物样本中含有自由巯基多肽的烷基化前处理和串联质谱检测方法。

背景技术

目前针对生物样本中含有巯基多肽的检测，全血分离出血浆后，在特定温度或pH条件下，用自合成的芳香季胺化咪唑进行较长时间衍生处理，使用灵敏度较低的方法进行检测。

目前生物样本中含巯基多肽的衍生化方法存在许多不足：

1、样本前处理复杂，部分需要预先分离出血浆；

2、操作烦琐，需要在特定温度，特定pH条件下反应；

3、所需时间长，衍生化不彻底，重复性和灵敏度差；

4、衍生化处理后直接上机检测，或使用pH接近中性或偏碱性的蛋白沉淀试剂，如甲醇、乙腈等，这类试剂沉淀蛋白效果不佳，导致杂质残留多，影响目标物的检测和分离。

因此，市面上亟需一种能够解决上述一个或者多个问题的针对巯基多肽生物样本的前处理方法以及对该生物样本的检测方法。

发明内容

为解决现有技术中存在的一个或者多个问题，本发明提供了一种针对巯基多肽生物样本的前处理方法以及对该生物样本的检测方法。

本发明为达到上述目的所采用的技术方案是：一种针对巯基多肽生物样本的前处理方法，所述方法包括：

步骤01、制备巯基烷化剂，装入到若干EP管中备用；

步骤02、分别在步骤01中的各个EP管中加入不同浓度的巯基多肽物质标曲工作液和待测样品；

步骤03、分别在步骤02的各个EP管中加入巯基多肽物质内标工作液，充分混匀后在室温中静置；

步骤04、分别在步骤03的各个EP管中加入SSA蛋白沉淀剂，涡旋混匀，离心处理；

步骤05、从步骤04的各个EP管中取出上清液，加入到装有超纯水的EP管中，涡旋混匀；

步骤06、从步骤05各管中取出混合液，分别加入装有超纯水的EP管中，涡旋混匀，转移到96孔板中，封膜待测。

在一些实施例中，所述步骤01中的巯基烷化剂包括N-R基顺丁烯二酰亚胺。

在一些实施例中，所述N-R基顺丁烯二酰亚胺为N-甲基顺丁烯二酰亚胺，N-乙基顺丁烯二酰亚胺，N-苄基顺丁烯二酰亚胺中的一种或几种。

在一些实施例中，所述步骤01中制备巯基烷化剂包括：

步骤11、准确称取100.1mg的N-乙基顺丁烯二酰亚胺，和59.6mg的乙二胺四乙酸二钠；

步骤12、将步骤11中称取的N-乙基顺丁烯二酰亚胺和乙二胺四乙酸二钠加入到40ml的超纯水中，震荡混匀2min，即得20mM的巯基烷化剂。

在一些实施例中，所述步骤03中充分混匀后需要在室温中静置15min。