[发明专利]一步法Gateway反应构建表达载体的方法及应用

说明书

本发明公开了一种一步法Gateway反应构建表达载体的方法及应用，旨在解决现有技术构建表达载体耗时、操作繁琐、成功率低，成本高昂的技术问题。该方法为：以L1‑F、L1‑R、L2‑F和L2‑R为引物扩增含有attL1、attL2的DNA片段；以上下游序列包括目的基因的特异序列和接头序列的特异引物扩增目的基因；将含有attL1片段、含有attL2片段和目的基因片段混合，利用L1‑F和L2‑F进行融合PCR，得含attL重组位点的目的基因；将含有attL重组位点的目的基因与目标载体进行LR反应，得目的基因表达载体。本发明应用于在植物或微生物中表达目的基因，特异性高、成功率100%，操作简单、成本低。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种一步法Gateway反应构建表达载体的方法及应用。

背景技术

传统构建基因工程和分子生物学使用载体，常规采用的方法是酶切和连接，对DNA目的片段DNA进行切割并且回收，既浪费时间过程又繁琐，当质粒载体的分子量比较大时，用酶切和连接的方法构建载体成功率不高。

Gateway技术是Invitrogen已经商业化的技术，它是基于噬菌体的位点特异性重组反应，在目的片段添加重组位点，将两端含有attB1/2位点序列的PCR产物与含attP1/2重组位点的供体载体（Donor clone）混合进行BP反应获得入门载体(Entry clone)，入门载体中目的基因两端为attL1/2重组位点序列，入门载体可以和不同用途的含有attR1/2重组位点的目标载体（Destination clone）进行LR反应获得相应的表达载体（Expressionclone），表达载体中目的基因两侧的位点重组为attB1/2位点。也就是说利用该技术获得表达载体通常需要通过BP反应和LR反应两个步骤，第一步BP反应使目的基因两侧重组位点为attL，第二步使目的基因两侧序列为较短的attB。然而，Gateway 两步反应所用到的酶都很贵，导致成本高昂，制约了Gateway技术更好的使用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种一步法Gateway反应构建表达载体的方法及应用，以解决现有技术中构建表达载体耗时、操作繁琐、成功率低，成本高昂的问题。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一步法Gateway反应构建表达载体的方法，包括以下步骤：

（1）以L1-F和L1-R为引物扩增含有attL1的DNA片段；以L2-F和L2-R为引物扩增含有attL2的DNA片段；所述引物L1-F、L1-R、L2-F和L2-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～4所示；

（2）以特异引物扩增目的基因；所述特异引物的上下游序列包括目的基因的特异序列和接头序列；所述上游接头序列为所述引物L1-R的互补序列中任一连续22bp的序列；所述下游接头序列为所述引物L2-R的互补序列中任一连续22bp的序列；

（3）将含有attL1的DNA片段、含有attL2的DNA片段和目的基因片段混合，利用所述引物L1-F和L2-F进行融合PCR，得含有attL重组位点的目的基因片段；

（4）将所得含有attL重组位点的目的基因片段与目标载体进行LR反应，即得目的基因表达载体。