[发明专利]vp19转基因蓝藻及其在制备防治对虾白斑综合征病毒药物中的用途

说明书

本发明公开了vp19转基因蓝藻及其在制备防治对虾白斑综合征病毒药物中的用途，通过vp19穿梭质粒转入蓝藻构建vp19转基因蓝藻，以对虾白斑综合症病毒的基因组DNA为模板，设计扩增引物进行PCR扩增，得到的vp19基因与pRL489质粒连接，构建vp19穿梭表达载体并转入大肠杆菌，将含有pR4‑pRL‑542质粒的大肠杆菌、含有pRL489‑vp19质粒的大肠杆菌和纯化后的野生型蓝藻培养后按比例混合，三亲接合转移得到蓝藻转化子，继续培养。所得的vp19转基因蓝藻作为活性成分用于制备防治对虾白斑综合征病毒药物，有效使用剂量为1～20μg/尾，效果显著且易于控制成本。

技术领域

本发明属于蓝藻生物工程技术领域，具体涉及通过质粒载体重组构建、引物合成、酶切、 普通PCR、三亲接合转移法、RT-PCR的方法获得vp19转基因蓝藻，并用于制备防治对虾白 斑综合征病毒药物。

背景技术

白斑病是由白斑综合症病毒(White Spot Syndrome Virus，WSSV)引起的，每年对全球对 虾养殖业造成巨大的经济损失。WSSV病毒是一种杆状DNA病毒，虾一旦感染WSSV就会 发展为白斑综合症，然后在2-7天内迅速死亡，死亡率高达100％，至今尚无规模应用的有效 药物防治。近年来，WSSV防治在免疫研究进展较大，vp19是WSSV上含量较多的囊膜蛋白 之一，研究主要将vp19蛋白融合进大肠杆菌、酵母菌、动物细胞等载体，并进行纯化后的小 规模室内实验，但细菌等无法直接投喂对虾充当饵料，限制其在WSSV防治大规模商业应用。

发明内容

本发明的主要目的在于克服对虾感染白斑综合症病毒死亡率高且至今尚无规模应用的有 效药物防治，构建vp19穿梭质粒并首次转入蓝藻中，制得vp19转基因蓝藻，大规模用于防 治对虾白斑综合征病毒，实现“药食同源”效果。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

第一方面，vp19转基因蓝藻的构建方法，包括以下步骤：

(ⅰ)以对虾白斑综合症病毒的基因组DNA为模板，设计扩增引物对如SEQ ID.NO.1和SEQ ID.NO.2所示，用PCR法扩增获得vp19基因；

(ⅱ)步骤(ⅰ)所得vp19基因和pRL489质粒连接，构建vp19穿梭表达载体并转入大肠杆菌， 得到含有pRL489-vp19质粒的大肠杆菌；

(ⅲ)将含有pR4-pRL-542质粒的大肠杆菌、步骤(ⅱ)获得的含有pRL489-vp19质粒的大肠杆 菌和纯化后的野生型蓝藻培养到对数生长中期，并按照细胞数量比为5：5：1混合，通过三亲 接合转移用带vp19基因的载体转化蓝藻，并筛选蓝藻转化子；

(ⅳ)步骤(ⅲ)所得蓝藻转化子继续培养，得到vp19转基因蓝藻；和/或还包括

(ⅴ)vp19转基因蓝藻培养后沉淀、离心、收集、洗涤、冷冻干燥和粉碎的后处理步骤。

优选地，所述蓝藻为聚球藻。

第二方面，vp19转基因蓝藻在制备防治对虾白斑综合征病毒药物中的用途。

优选地，vp19转基因蓝藻在制备防治对虾白斑综合征病毒口服疫苗或免疫促进剂的用途。

第三方面，防治对虾白斑综合征病毒药物组合物，以vp19转基因蓝藻为有效活性成分， 其有效使用剂量为1～20μg/尾，还包括渔业药学上可接受的载体或辅料。

优选地，所述的vp19转基因蓝藻的有效使用剂量为10～20μg/尾。

优选地，所述药物组合物的剂型为粉剂、颗粒剂、胶囊、片剂或丸剂。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：