[发明专利]一种双标记探针及其在SNP分型及肿瘤突变的应用

权利要求书

1.一种双标记探针，其特征在于，包括：对探针5’端尾巴序列上做荧光标记，对靶特异结合序列的次位碱基进行淬灭基团标记；所述5’端尾巴序列的长度为2-8个碱基，是人为添加的碱基序列，与靶序列不互补配对；所述靶特异结合序列的长度为16-28nt，与靶序列有0-1个碱基不匹配。

2.根据权利要求1所述的一种双标记探针，其特征在于，探针的修饰方式为：若靶特异结合序列的次位碱基非T，即在5’端尾巴中的T碱基上修饰荧光基团，在次位碱基引入T碱基，并在T碱基上修饰淬灭基团。

3.根据权利要求1所述的一种双标记探针，其特征在于，探针的修饰方式为：若靶特异结合序列的次位碱基为T，即在5’端尾巴中引入的T碱基上修饰荧光基团，在次位T碱基上修饰淬灭基团。

4.一种双标记探针在SNP分型的应用，其特征在于，检测SNP分型的过程为：

步骤一，根据SNP各个等位基因型分别设计野生型检测探针和突变型检测探针，分别标记各个荧光基团，野生型探针的靶特异结合序列与野生型模板有0-1个碱基不匹配，与突变型模板存在1-2个碱基不匹配；突变型检测探针与突变型模板有0-1个碱基不匹配，与野生型模板存在1-2个碱基不匹配；设计上下游引物，可同时扩增野生型和突变型模板；

步骤二，配制PCR反应体系，设置反应程序，加模板，上机PCR；

步骤三，根据荧光PCR仪给出的CT值和各个通道荧光采集结果，对SNP等位基因型进行判读。

5.一种双标记探针在肿瘤突变的应用，其特征在于，检测体细胞突变的过程为：

步骤一，根据突变位点设计突变型探针，在探针的5’端尾巴序列上修饰荧光基团，在靶特异性结合序列的第二个碱基上修饰淬灭基团，该探针与突变型模板有0-1个碱基不匹配，与野生型模板有1-2个碱基不匹配；

步骤二，设计特异性上游引物和下游引物；

步骤三，配置PCR反应体系；

步骤四，加样，上机，检测靶序列。

6.根据权利要求5所述的一种双标记探针在肿瘤突变的应用，其特征在于，检测p.E545K位点体细胞突变的过程为：

步骤一，设计突变型探针E545K-MT-P，序列如SEQ NO.01，其中，在探针的5’端尾巴的T碱基上修饰荧光基团，在靶特异结合序列的次位碱基位置引入碱基T，并在其上修饰淬灭基团；探针与突变型模板有1个碱基不匹配，与野生型模板有2个碱基不匹配；

步骤二，设计上游引物E545K-F，序列为SEQ NO.03，下游引物E545K-R，序列为SEQNO.04；

步骤三，配置PCR反应体系；

步骤四，加入p.E545K突变型质粒，上机，检测靶序列。

7.根据权利要求6所述的一种双标记探针在肿瘤突变的应用，其特征在于，在探针的5’端尾巴序列上修饰的荧光基团为FAM。

8.根据权利要求6所述的一种双标记探针在肿瘤突变的应用，其特征在于，在靶特异性结合序列的碱基上修饰的淬灭基团为BHQ1。