[发明专利]一种基于QCM的细胞检测方法

权利要求书

1.一种基于QCM的细胞检测方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)晶片的清洗；Ramos细胞的培养、磁珠的预处理、Ramos细胞置换tDNA、晶片的修饰、晶片的进一步修饰和结晶

(2)Ramos细胞的培养：将Ramos细胞复苏，并将复苏后的Ramos细胞加入培养液中分散均匀，进行离心，倒掉上层清液的同时去除细胞中的凋亡细胞；离心后的细胞用细胞培养液分散均匀，移至培养瓶中，并在显微镜下观察细胞状态，将培养瓶放在培养箱中进行孵育，获得Ramos细胞溶液；

(3)磁珠的预处理：

①取一定量羧基化的Fe₃O₄磁珠MNPs-COOH，用0.1M的咪唑盐酸溶液吹打洗涤三次，每次对其进行磁分离，弃去上层清液；

②清洗后的磁珠中加入0.1M EDC和0.1M NHS对磁珠进行活化，温度保持在37℃，活化30分钟；活化结束后，在磁珠中加入适配体TDO5，在37℃下反应过夜，得到连接适配体后的磁珠MNPs-a；

③连接适配体后的磁珠用1xPBS吹打洗涤三次，每次对其进行磁分离，弃去上层清液，加入1xPBS对磁珠进行稀释；

④将MNPs-a溶液与tDNA溶液进行混合杂交，温度保持在37℃，反应1小时，得到MNPs-a与tDNA的杂交体MNPs-a-t；

⑤杂交结束后，用1xPBS吹打洗涤三次，每次对其进行磁分离，弃去上层清液，加入1xPBS对其进行稀释，备用；

(4)Ramos细胞置换tDNA：将Ramos细胞溶液与制备的MNPs-a-t进行混合，温度保持在37℃，反应30分钟；反应结束后，进行磁分离，使磁珠与上层清液分离；

(5)晶片的修饰：

①将清洗干净的晶片平铺在小烧杯底部，然后将1μM的cDNA溶液加入小烧杯中，在气浴恒温振荡器中保持37℃反应12h；

②反应结束后，将晶片取出，冲洗掉晶片上未反应的物质并平铺在小烧杯底部；

③称取HS-C₁₁-NMe₃Cl，溶解配置成10mM的溶液，将其加入小烧杯中，在气浴恒温振荡器中保持37℃反应12h；

④反应结束后，将晶片取出，冲洗掉晶片上未反应的物质，将晶片在氮气氛围中吹干备用；

(6)晶片的进一步修饰：

①将吹干的晶片平铺在小烧杯底部，将Ramos细胞置换出来的tDNA上层清液加入小烧杯中，在气浴恒温振荡器中保持37℃反应1h；

②反应结束后，将晶片取出，冲洗掉晶片上未反应的物质并平铺在小烧杯底部；

③配制过量浓度pDNA，将其加入小烧杯中，在气浴恒温振荡器中保持37℃反应1h；

④反应结束后，将晶片取出，冲洗掉晶片上未反应的物质，将晶片在氮气氛围中吹干备用；

(7)结晶：将修饰好的晶片，安装在石英晶体微天平检测系统的开放式检测池中，打开QCM软件，预热至37℃，并开始测量；当共振频率在空气中稳定在±2Hz内时，在开放式检测池中加入500μl6mM CaCl₂溶液，当共振频率稳定在±2Hz内后，在反应空间内加入过量的碳酸铵固体粉末；通过石英晶体微天平传感器记录下具有不同修饰的石英晶体微天平晶片表面的结晶化过程中的信号响应，当信号达到稳定后，保存数据。

2.根据权利要求1所述的一种基于QCM的细胞检测方法，其特征在于，步骤(1)所述晶片的清洗步骤如下：将晶片在食人鱼洗液中浸泡10分钟，然后按照H₂O：H₂O₂：NH₃·H₂O＝5:1:1的体积比配制碱液，将配制好的碱液在电热套上加热煮沸，晶片置于煮沸的碱液中浸泡15分钟；用超纯水冲洗并在超纯水中浸泡5分钟，再用无水乙醇冲洗并在无水乙醇中浸泡5分钟；用氮气吹干，将干燥好的晶片放在净化工作台中紫外线下照射20分钟。