[发明专利]一种基于固态纳米孔结肠癌kras基因突变检测方法

说明书

本发明公开了一种基于固态纳米孔结肠癌kras基因突变检测方法,包括以下步骤：A、将流体装置以及垫片进行清洗，吹干待用；B、将前后的纳米孔分别和垫片，流体装置组装在一起；C、组装完之后的纳米孔芯片分别组成了小腔室；D、将1M/1M KCl溶液注入到纳米孔芯片的小腔室内；E、测量修饰纳米孔前后的电流和电压；F、在cis面的溶液中加入目标碱基的K‑ras癌基因片段，突变型基因密码子发生了点突变，导致酶切位点丢失，所以不会被切断，本发明突变型基因密码子发生了点突变，导致酶切位点丢失，所以不会被切断，经电压反馈控制将突变的K‑ras基因和野生型的K‑ras基因测量电输出信号，通过测量离子电流的变化实现K‑ras基因突变的检测。

技术领域

本发明涉及基于固态纳米孔结肠癌kras基因突变检测技术领域，具体为一种基于固态纳米孔结肠癌kras基因突变检测方法。

背景技术

结肠癌是常见的发生于结肠部位的消化道恶性肿瘤，好发于直肠与乙状结肠交界处，以40～50岁年龄组发病率最高，男女之比为2～3：1。发病率占胃肠道肿瘤的第3位。结肠癌主要为腺癌、黏液腺癌、未分化癌。大体形态呈息肉状、溃疡型等。结肠癌可沿肠壁环行发展，沿肠管纵径上下蔓延或向肠壁深层浸润，除经淋巴管、血流转移和局部侵犯外，还可向腹腔内种植或沿缝线、切口面扩散转移。慢性结肠炎患者、结肠息肉患者、男性肥胖者等为易感人群。

据世界卫生组织(WHO)统计，全球结直肠癌每年新发病例数约120万，年死亡人数达60余万。随着靶向治疗药物表皮生长因子受体抑制剂(epidermal growth factorreceptor inhibitor，EGFRI)西妥昔单抗和帕尼单抗的问世，结直肠癌的治疗进入靶向治疗时代。而KRAS基因是影响肿瘤细胞对EGFRI响应性的重要预测性生物标志物。KRAS基因与CRC的关系密切，在CRC中的突变率为35％～45％。KRAS基因发生突变后，会导致表皮生长因子受体(EGFR)依赖的RASRAF-MAPK信号通路持续激活，引起细胞过度增殖和分化，从而诱发CRC。多个研究证实，肿瘤KRAS基因突变后对EGFRI(如西妥昔单抗、帕尼单抗)治疗不敏感。美国国立综合癌症网络(NCCN)结直肠癌临床实践指南2008年版已经指出：所有转移性结直肠癌患者均应进行KRAS基因检测，仅对KRAS基因野生型患者推荐接受EGFRI治疗。因此，临床上将KRAS基因突变状态作为一个重要的治疗标志物，它与结直肠癌的预后和治疗效果密切相关。

结肠癌发病的主要与高脂肪和低纤维素饮食有关。结肠的慢性炎症使肠癌的发生率比一般人群高。有结肠息肉者，结肠癌发生率是无结肠息肉者的5倍。家族性多发性肠息肉瘤，癌变的发生率更高。遗传因素可能也参与结肠癌的发病。

K-ras基因是公认的癌基因，在结肠癌突变率可达30～60％。约90％的K-ras基因突变发生在突变热点2号外显子12、13密码子上，其密码子12是发生突变的热点位置。临床上靶向新药爱必妥(Erbitux)和帕尼单抗(Panitumumab)仅适用于无突变的K-ras基因野生型患者，对K-ras突变患者无效。因此，检测K-ras基因突变对于指导结直肠癌患者的靶向治疗具有重要意义。

传统的K-ras基因突变检测方法有三种：直接测序(例如聚合酶链式反应)、DNA杂交和限制酶分解方法(Botezatu,et al.,2017；Su,et al.,2017；Stancescu,et al.,2016)。基于光学、电化学、压电利用互补DNA或肽核酸探针检测特定靶核酸序列是目前检测基因突变最流行的方法之一(Toren,et al.,2015)。然而，以上方法耗时，需标记和昂贵的设备。因此，亟待研究一种强大、高效、精准、快速的原位K-ras基因突变检测新方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于固态纳米孔结肠癌kras基因突变检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于固态纳米孔结肠癌kras基因突变检测方法,包括以下步骤：