[发明专利]一种从脐带血分离总有核细胞与单个核细胞的方法

说明书

本发明提供了一种从脐带血分离总有核细胞与单个核细胞的方法：首先分离TNCs：脐带血中加入含5%右旋糖酐及2%人血清白蛋白的PBS缓冲液，离心弃上清，获得TNCs沉淀I；沉淀洗涤后获得TNCs沉淀；将TNCs沉淀用Ficoll淋巴细胞分离液密度梯度离心，收集单个核细胞白膜层，离心后获得单个核细胞沉淀。该方法高效、方便、省时、可重复性高，可以利用脐血库丰富的冻存脐血资源，提高冻存脐带血中衍生干细胞和免疫细胞的分离效率。

技术领域

本发明属于医学领域，涉及一种获得有核细胞的方法，具有涉及一种从脐带血中分离总有核细胞与单个核细胞的方法。

背景技术

脐带血（Umbilical cord blood，UCB）已成为除骨髓以外的重要干细胞来源，据不完全统计，迄今为止全世界范围内先后建立起多个标准化、规范化的脐血库，共储存了几十万份冻存的脐血，并且以每日近千例的速度迅速增加，旨在将来能够用于临床治疗。脐血中富含多种干/祖细胞和多种免疫细胞，包括造血干细胞和内皮祖细胞等，对治疗多种恶性血液肿瘤、获得性或者遗传性骨髓衰竭综合征和非恶性疾病（脊髓损伤、肝硬化、糖尿病、心肌损伤和自身免疫性）等疾病效果显著，且具有来源充足、免疫原性更弱、供者无痛苦、不涉及伦理问题、传播疾病的几率低等优点。

目前公共脐血库利用率不足10%，为拓展脐血的临床应用，越来越多的学者开始关注脐血中除造血干细胞外，其它衍生的间充质干细胞、内皮祖细胞、调节性T细胞、NK细胞等在临床治疗中的应用前景。脐带血中各种衍生细胞的来源主要为脐带血总有核细胞（Totalnuclear Cell，TNC），尤其是单个核细胞（Mononuclear Cell，MNC）。冻存脐带血的再利用需经过深低温状态和复苏两个过程，不可避免地会引起细胞理化性质的变化，从而影响干细胞及免疫细胞的生物特性，尤其是增殖能力。因此选择合适的脐带血复苏方法，高效获得总有核细胞和单个核细胞，尽可能完整地保有其生物学功能，能够有效提高总有核细胞和单个核细胞衍生的干/祖细胞和免疫细胞的分离效率，确保脐血库公共库脐带血资源的利用率，具有巨大的市场需求及重要的临床意义。

虽然国内外不同脐血库先后报道多种冻存脐带血复苏的方法，但是受脐带血个体差异、脐带血血浆红细胞去除方法、冻存液不同等因素影响，脐带血的复苏方法不统一而且效率存在很大差异。因此如何高效复苏冻存脐带血中获得高活率的总有核细胞和单个核细胞仍是一大难题。

发明内容

针对目前冻存脐带血获得有核细胞活率低的问题，本发明提供了一种从冻存脐血中高效复苏获得总有核细胞及单个核细胞的方法。该方法高效、方便、省时、可重复性高，提高了冻存脐带血中衍生干细胞和免疫细胞的分离效率。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种从脐带血分离总有核细胞与单个核细胞的方法，包括以下步骤：

（1）分离TNCs：脐带血中加入含5%w/v右旋糖酐及2%w/v人血清白蛋白的PBS缓冲液，离心弃上清，获得TNCs（总有核细胞）沉淀I；

（2）洗涤TNCs：将TNCs沉淀I用含5%右旋糖酐及2%人血清白蛋白的PBS缓冲液重悬后，离心弃上清，获得TNCs沉淀；

（3）分离单个核细胞白膜层：将TNCs沉淀再次用含5%右旋糖酐及2%人血清白蛋白的PBS缓冲液重悬后，加入等体积Ficoll淋巴细胞分离液中，密度梯度离心，然后收集单个核细胞白膜层；

（4）分离MNCs：将单个核细胞白膜层离心，弃上清液，获得MNCs（单个核细胞）沉淀。

步骤（1）中，所述脐带血与PBS缓冲液的体积比为1:3-1:4。

所述脐带血可以为新鲜获取的脐带血，也可以为液氮冻存复苏后的脐带血。

所述PBS缓冲液配方为137mM氯化钠、2.7mM氯化钾、2mM磷酸二氢钾和10mM磷酸氢二钠，pH为7.3-7.5。