[发明专利]基于CjCas9和VPR核心结构域的融合蛋白、相应的DNA靶向激活系统及其应用

说明书

本发明公开了一种基于CjCas9和VPR核心结构域的融合蛋白、相应的DNA靶向激活系统及其应用，融合蛋白，包括两个异源多肽结构域，其中一个多肽结构域包含具有转录激活活性的VPR蛋白；另一种多肽结构域包含CjCas9蛋白，所述CjCas9蛋白为dCjCas9亚型、mini‑dCjCas9亚型或CjCas9野生型，所述dCjCas9亚型中含有D8A和H559A单位点氨基酸突变；所述mini‑dCjCas9亚型包含D8A单位点氨基酸突变以及大部分HNH结构域的缺失。一种DNA靶向激活系统，包括上述所述的融合蛋白和至少一种向导RNA，所述向导RNA包含针对目的基因启动子区域设计的一段长度为14bp‑22bp的序列和一段80bp的骨架序列。上述所述的DNA靶向激活系统在进行基因的靶向激活中的应用。本发明提供的DNA靶向激活系统具有体积小特异性高，激活效果强易于合成，成本低等优点。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种基于CjCas9及其突变体和VPR核心结构域的融合蛋白、相应的DNA靶向激活系统及其应用。

背景技术

CRISPR/Cas9系统是目前应用广泛的基因编辑系统，是从细菌和古细菌降解外源DNA的适应性免疫机制改造而来。CRISPR/Cas9系统主要包含两个元件：Cas9蛋白和向导RNA。Cas9蛋白和向导RNA结合后会在向导RNA的引导下对特定位点DNA双链进行切割，从而产生断裂，这比之前的基因编辑方法要简单得多。而近年来，CRISPR/Cas9系统也逐渐应用于基因调节领域。利用失去切割活性的CRISPR/Cas9系统并结合转录激活或者抑制因子，也可以在真核以及原核生物激活或抑制基因的表达，这些使CRISPR系统可能成为下一基因治疗的有利平台。

CjCas9来源于空肠弯曲菌，与其他CRISPR系统相比，它具有以下优势：首先，PAM区不同。CRISPR系统对DNA的靶向受到PAM区的限制，CjCas9的PAM区为NNNVRYAC,不同于SpCas9识别G-rich PAM，Cpf1复合物识别的T-rich PAM序列,这为CRISPR系统的编辑位点提供了更多的选择。其次，特异性不同。相对于SpCas9具有较高的脱靶率，CjCas9具有更高的特异性。更重要的是，大小不同。CjCas9是目前已知的最小的Cas9蛋白，相比于SpCas9有1368个氨基酸，CjCas9只有984个氨基酸，更容易进入组织和细胞，这极大地拓展了CRISPR系统在体内外的应用。

VPR是三种转录激活因子vp64、p65和rta的核心结构域组成的融合蛋白。一方面，它具有这三种转录激活因子的协同作用，使其能在更多的位点实现更好的激活效果。另外一方面，它是由这三种转录激活因子的核心结构域组成的融合蛋白，长度仅325个氨基酸，提高了它的应用范围。

目前，CRISPR/Cas9系统对基因的调控主要应用于体外，而在体内应用较少，其原因有很多，其中最重要的是大部分Cas9蛋白较大，超过了一些包装方法如AAV病毒的包装范围，再结合转录调节系统，更是超过了大部分包装系统的容量，使得调节系统很难传递到体内的组织细胞发挥作用。同时基因调节的效果以及系统的特异性也是其局限因素。在本发明中，将目前体积最小的CjCas9蛋白和三种转录激活因子vp64、p65和rta的核心结构域组成的融合蛋白VPR结合，整个激活系统具有小体积、强激活效果以及高特异性。可以通过一些常用的包装方法如AAV病毒传递至体内，发挥其激活效果。

发明内容

本发明目的在于：针对已有基因激活方法靶向性低，激活效率低，以及系统体积过大难以应用于体内等问题，将目前体积最小的CRISPR/Cas9系统蛋白CjCas9和转录激活因子VPR结合，提供一种体积小、激活效果强以及高特异性的激活系统，可以实现体内外高效的基因激活。