[发明专利]用于结直肠癌和腺瘤辅助诊断的试剂盒及其使用方法

权利要求书

1.一种用于结直肠癌和腺瘤辅助诊断的试剂盒，其特征在于，包括引物组合物、探针组合物和封闭序列组合物，所述引物组合物由用于检测NDRG4基因的引物对BS-N4-F和BS-N4-R、用于检测SDC2基因的引物对BS-SDC2-F和BS-SDC2-R以及用于检测作为内参的ACTB基因的引物对BS-ACT-F和BS-ACT-R组成，

所述BS-N4-F的DNA序列如SEQ ID NO.1所示，

所述BS-N4-R的DNA序列如SEQ ID NO.2所示，

所述BS-SDC2-F的DNA序列如SEQ ID NO.3所示，

所述BS-SDC2-R的DNA序列如SEQ ID NO.4所示，

所述BS-ACT-F的DNA序列如SEQ ID NO.5所示，

所述BS-ACT-R的DNA序列如SEQ ID NO.6所示，

所述探针组合物由NDRG4基因的探针BS-N4-P、SDC2基因的探针BS-SDC2-P和ACTB基因的探针BS-ACT-P组成，

所述BS-N4-P的DNA序列如SEQ ID NO.7所示，

所述BS-SDC2-P的DNA序列如SEQ ID NO.8所示，

所述BS-ACT-P的DNA序列如SEQ ID NO.9所示，

所述封闭序列组合物由NDRG4基因的封闭序列BS-N4-C和SDC2基因的封闭序列BS-SDC2-C组成，

所述BS-N4-C的DNA序列如SEQ ID NO.10所示，

所述BS-SDC2-C的DNA序列如SEQ ID NO.11所示。

2.根据权利要求1所述的用于结直肠癌和腺瘤辅助诊断的试剂盒，其特征在于，所述BS-N4-C和所述BS-SDC2-C的3’端均进行磷酸化修饰。

3.根据权利要求1所述的用于结直肠癌和腺瘤辅助诊断的试剂盒，其特征在于，所述BS-N4-P采用ROX和BHQ2标记，所述BS-SDC2-P采用CY5和BHQ2标记，所述BS-ACT-P采用HEX和BHQ1标记。

4.根据权利要求1所述的用于结直肠癌和腺瘤辅助诊断的试剂盒，其特征在于，所述引物组合物中各引物的浓度为0.1μM～0.2μM，所述探针组合物中各探针的浓度为0.1μM～0.2μM，所述封闭序列组合物中各封闭序列的浓度为0.1μM～0.2μM。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的用于结直肠癌和腺瘤辅助诊断的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Hot start Taq酶、10×buffer、dNTPs、NH₄Cl、DMSO和去离子水。

6.根据权利要求5所述的用于结直肠癌和腺瘤辅助诊断的试剂盒，其特征在于，所述dNTPs浓度为10mM，所述NH₄Cl的浓度为250mM，所述DMSO的体积浓度为100％。

7.一种如权利要求1～6中任一项所述的用于结直肠癌和腺瘤辅助诊断的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)采样：采集粪便样本置于粪便样本保护液中；

(2)提取：采用磁珠法进行粪便DNA提取；

(3)转化：对提取的粪便DNA进行重亚硫酸盐转化及纯化；

(4)检测：将转化及纯化后的粪便DNA用试剂盒进行荧光定量PCR检测；

(5)结果分析：当ACTB基因的CT值＜37时，NDRG4基因的CT值＜37或SDC2基因的CT值＜42，判断为阳性；

当ACTB基因的CT值＜37时，NDRG4基因的CT值≥37且SDC2基因的CT值≥42，判断为阴性；

当ACTB基因的CT值≥37时，检测结果无效，需重新检测。

8.根据权利要求7所述的用于结直肠癌和腺瘤辅助诊断的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述荧光定量PCR检测的反应程序为：50℃预变性2min，95℃变性10min，然后以95℃变性15s、60℃退火30s为一个循环进行45次，最后20℃保持2min。