[发明专利]检测基因型的RNA环化效率的方法

权利要求书

1.一种检测基因型的RNA环化效率的方法，其特征在于，所述方法主要包括如下的步骤：

1)根据环状RNA与线性RNA在结构上的不同，分别设计所述环状RNA的上、下游引物与所述线性RNA的上、下游引物，以区分所述线性RNA和所述环状RNA；

2)根据所述基因型所对应的基因型位点设计探针；

3)使用步骤1)和2)中所获得的所述上、下游引物和所述探针，通过ddPCR仪对待测cDNA样品分别进行所述线性RNA和所述环状RNA的绝对定量检测，得到所述基因型的环状RNA序列拷贝数和所述基因型的线性RNA序列拷贝数；

4)根据如下公式计算所述基因型的RNA环化效率：

所述RNA环化效率＝所述基因型的环状RNA序列拷贝数/(所述基因型的环状RNA序列拷贝数+所述基因型的线性RNA序列拷贝数)。

2.根据权利要求1所述的检测基因型的RNA环化效率的方法，其特征在于，在步骤2)中，所述基因型所对应的基因型位点为等位基因的SNP位点。

3.根据权利要求2所述的检测基因型的RNA环化效率的方法，其特征在于，在步骤1)中，所述环状RNA的序列包括反向剪切位点和所述SNP位点，设计所述扩增环状RNA序列的上、下游引物时，使所述反向剪切位点和所述SNP位点位于所述环状RNA的上、下游引物在所述环状RNA的序列上的结合位点之间。

4.根据权利要求2所述的检测基因型的RNA环化效率的方法，其特征在于，在步骤1)中，所述线性RNA的序列包括所述SNP位点，设计所述扩增线性RNA序列的上、下游引物时，所述SNP位点位于所述线性RNA的上、下游引物在所述线性RNA的序列上的结合位点之间，其中，所述线性RNA的上、下游引物中的任意一条的所述结合位点位于与所述环状RNA不同的所述线性RNA的序列上。

5.根据权利要求4所述的检测基因型的RNA环化效率的方法，其特征在于，步骤2)中，所述探针是根据所述SNP位点设计。

6.根据权利要求5所述的检测基因型的RNA环化效率的方法，其特征在于，使用荧光基团进行标记所述探针。

7.根据权利要求1所述的检测基因型的RNA环化效率的方法，其特征在于，所述步骤3)具体包括如下步骤：

(a)提取样品的总RNA，并反转录为所述cDNA；

(b)将所述cDNA作为模板，与所述上、下游引物、所述探针和ddPCR试剂液配制成反应液，加入到微滴发生卡上；

(c)将所述微滴发生卡放入微滴生产器中，将每个所述反应液分成多个微滴；

(d)将所述微滴转移到96孔板上，在PCR仪中进行扩增；

(e)将扩增后的所述96孔板放入微滴分析仪，按顺序吸取每个样品的所述微滴，并随载液流逐步通过检测器；

(f)有荧光信号的所述微滴为阳性，无荧光信号的所述微滴为阴性；软件记录每个样品中所述阳性微滴的比例，并给出所述基因型的环状RNA序列拷贝数和所述基因型的线性RNA序列拷贝数。

8.根据权利要求1所述的检测基因型的RNA环化效率的方法，其特征在于，所述基因型为一个、两个或者多个。

9.一种用于检测基因型的RNA环化效率的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒根据如权利要求1-8中任意一项所述的方法检测基因型的RNA环化效率，所述试剂盒至少包括可以区分线性RNA和环状RNA的上、下游引物，以及可以用于区分所述基因型的探针。