[发明专利]一种丙氨酸消旋酶的突变体酶蛋白及其制备方法

说明书

本发明公开了一种丙氨酸消旋酶的突变体酶蛋白及其制备方法。根据同源序列二级结构比对结果，通过定点突变技术将腾冲嗜热厌氧菌中丙氨酸消旋酶的173、360两个位点分别突变，构建双点突变表达载体pET‑S173Q/Q360Y，通过原核表达、纯化获得酶蛋白。所获得的突变体蛋白对底物L‑Ala的表观二级速率常数k_cat/K_m为18.44 s^‑1·mM^‑1，平衡常数K_eq(L/D)为3.95，是野生型蛋白的68.30和3.69倍，且突变体蛋白的半衰期也有一定程度的提升。由于突变体蛋白可以提高反应产物D‑Ala的转化效率，因此，本突变体可以作为生物合成D‑Ala的元器件，有较好的应用价值。

技术领域

本发明涉及一种原核生物来源的丙氨酸消旋酶的突变体酶蛋白，属于基因工程和酶工程技术领域。

背景技术

丙氨酸消旋酶（Alanine racemase, Alr, EC 5.1.1.1）是一种以磷酸吡哆醛（Pyridoxal 5′-phosphate, PLP）为辅酶，具有催化L-丙氨酸和D-丙氨酸之间相互转化的功能，归类于异构酶家族。反应如下所示：

L-alanine⇄D-alanine

丙氨酸消旋酶主要来自原核生物，其催化反应产物D-丙氨酸是非天然氨基酸中的一类，D-丙氨酸不仅是细菌细胞壁肽聚糖层四肽尾的重要组成成分之一，在药物合成、食品、饲料和化妆品等行业也有着非常广泛的应用前景。

目前合成D-丙氨酸的方法主要有化学合成法、微生物发酵法和生物酶法三种，这三种方法各有其优缺点：化学合成法反应机制复杂、工艺过程长且生产成本较高；微生物法周期长、设备成本高，产物含量低，分离纯化困难；生物酶法有较好的区域和立体选择性、反应条件温和、操作简便、污染少等优点，但存在着酶蛋白稳定性差、活性低、生产成本高等不足。因此，开发一种高效的D-丙氨酸合成途径一直是广大科研工作者的关注点之一。

日本京都大学Kenji Soda教授曾提出利用甲酸脱氢酶、L-丙氨酸脱氢酶、丙氨酸消旋酶和D-氨基酸转氨酶四酶偶联合成D-氨基酸（Galkin et al., 1997）的思路，该方法实现了辅酶NADH的循环再生，降低了合成D-氨基酸的生产成本。然而，由于丙氨酸消旋酶催化反应为可逆平衡反应，其平衡常数K_eq(L/D）接近1.0，这决定了其反应产物D-丙氨酸的理论转化率不超过50%，使得反应液中D、L-丙氨酸并存（反应平衡状态下，二者比率接近1：1），增加了后续分离纯化获得D-丙氨酸的工艺复杂性。因此，开发获得具有高催化活性、稳定性好和转化效率高的丙氨酸消旋酶对于生物合成D-丙氨酸具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种酶活力高、稳定性好和转化效率提高的原核生物来源的丙氨酸消旋酶的突变体酶蛋白。

本发明的目的还在于提供一种丙氨酸消旋酶的突变体酶蛋白的制备方法。

本发明的目的是这样实现的。本发明提供的一种丙氨酸消旋酶的突变体酶蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。其中：

（1）SEQ ID No.1所示的丙氨酸消旋酶的氨基酸序列中第173位的丝氨酸（S）突变为谷氨酰胺（Q）；

（2）SEQ ID No.1所示的丙氨酸消旋酶的氨基酸序列中第360位的谷氨酰胺（Q）突变为酪氨酸（Y）。

本发明还提供编码上述突变体酶蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。