[发明专利]一种基于酶辅助循环信号放大的电化学急性白血病基因Pax-5a检测方法

权利要求书

1.一种用于非疾病诊断的基于酶辅助循环信号放大的电化学急性白血病基因Pax-5a检测方法，包括以下步骤：

（1）用三(2-羧基乙基)膦溶液处理巯基修饰的探针以减少二硫键的存在；将巯基修饰的探针转移到金电极上，使巯基修饰的探针与金电极表面结合，再淋洗金电极除去未结合的巯基修饰的探针，并用巯基乙醇溶液进行封闭，得到改性金电极；

（2）将发夹探针和不同浓度Pax-5a的标准溶液在反应管中混合，加入缓冲液体系，孵育一段时间；再加入引物、DNA聚合酶、三磷酸碱基脱氧核苷酸和限制性内切酶，孵育一段时间，然后通过加热使酶失活；

（3）将步骤（2）中的混合溶液转移到步骤（1）中的改性金电极上，孵育一段时间，淋洗除去残留的DNA；再将氯化血红素溶液转移到改性金电极上，孵育一段时间；

（4）采用三电极系统，以含有双氧水的HEPES缓冲液为电解液，以经过步骤（3）处理的改性金电极为工作电极，以饱和甘汞电极为参比电极，以Pt电极为对电极，采用差分伏安脉冲法检测电信号变化；

（5）根据检测到的电信号变化值及其对应的Pax-5a的标准溶液浓度，绘制标准曲线；

（6）对于未知浓度的待测液，按照步骤（2）至（4）并用待测液代替Pax-5a的标准溶液进行检测，根据检测到的电信号和标准曲线信号的对比，得出待测液中Pax-5a的浓度；

其中，巯基修饰的探针为5’-TGAGCTCCCCATGCCAGCGATTT-SH-3’，其浓度为0.1~0.7 μM；发夹探针为5’-CCCAACCCGCCCTACCCACTGAGTCTCCCCATGCCAGCTGAGGTTTTTCTCAGTGGGTTCAGC-3’，其浓度为1~10 μM。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：三(2-羧基乙基)膦溶液的浓度为2 mM；巯基乙醇溶液的浓度为2 mM。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：Pax-5a的标准溶液的浓度分别为500 pM、100 pM、50 pM、10 pM、5 pM、1 pM、500 fM、100 fM、10 fM、0 fM；引物为5’-ACCCA-3’，其浓度为1~10 μM；DNA聚合酶为Klenow Fragment，其浓度为5 U/μL；限制性内切酶为Nt.BbvCI，其浓度为10 U/μL。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：氯化血红素的浓度为2.5~25 μM。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在含有双氧水的HEPES缓冲液中，双氧水的浓度为3 mM，HEPES缓冲液的浓度为10 mM，pH为7.2。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在检测电信号变化时，施加电位的范围为-0.15 ~ -0.5 V，振幅为50 mV。