[发明专利]基于运动发酵单胞菌內源CRISPR-Cas系统的基因组大片段高效删除方法及其应用

说明书

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及基于运动发酵单胞菌內源CRISPR‑Cas系统的基因组大片段高效删除方法及其应用。其技术要点包括：构建含人工CRISPR表达单元的质粒；确定大片段编辑靶位点，针对编辑靶位点选取guideRNA序列，并设计引物；将guideRNA引物序列构建至含人工CRISPR表达单元的质粒上，构建载体；将供体DNA序列构建至载体上，获得编辑质粒；将编辑质粒转化至感受态细胞中进行编辑。本发明利用基于运动发酵单胞菌內源CRISPR‑Cas系统的高通量基因编辑平台，实现对该菌株基因组大片段删除的编辑目的，促进代谢工程、系统生物学及合成生物学的发展。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及基于运动发酵单胞菌內源CRISPR-Cas系统的基因组大片段高效删除方法及其应用。

背景技术

近年来，利用微生物进行代谢工程、系统生物学及合成生物学等方面的研究取得了良好的进展，为理性化设计、构建微生物细胞工厂，利用生物体活细胞或酶对可再生生物质，如纤维素等进行物质转化，生产生物能源，实现生物冶炼的工业化提供了重要的理论基础。生物能源再生化是解决人类目前面临的资源、能源短缺及环境污染严重等问题的有效手段之一。

运动发酵单胞菌因为能天然产酒精，对酒精耐受性高，可以利用玉米秸秆水解物生产 10.7％(v/v)的高浓度纤维素酒精；是目前已知的唯一可以在厌氧条件下通过Entner-Doudoroff (ED)途径代谢葡萄糖或果糖生产乙醇的微生物，其每代谢一分子的葡萄糖或者果糖只产生一分子的ATP，产能低，因而大部分碳源(95％)被转化为产物乙醇，只有约2-2.6％的碳源用于细胞生长，目标产物产率非常高；运动发酵单胞菌可在广泛的温度(24-45℃)及pH 范围(3.5-7.5)生长，是公认的GRAS(Generally Recognized As Safe)菌株等特性，被认为是理想的微生物细胞工厂。而且，其基因组大小仅为约2Mbp，在开展基因组精简工作，构建最适基因组细胞工厂方面具有很大优势。

最小基因组的构建通常情况下是将基因组中非必需的DNA序列进行删除，最有效的方法是进行大片段的敲除。然而，利用目前常规的遗传操作方法无法满足这一需求。虽然目前常用的基于CRISPR-Cas9的基因编辑工具可实现高通量的基因组编辑，但外源表达Cas9对运动发酵单胞菌的细胞毒性限制了该工具的应用。

常规的遗传学方法通过同源重组对基因进行敲除，但目前仅限于对单个小基因的敲除，由于这些方法直接利用宿主体内DNA重组修复系统，在无任何外源DNA损伤压力的情况下，重组效率极低，这一特点在基因组大片段删除上显得尤为突出。而且，对于每一个目标基因的敲除，均需要引入特定的选择标记，会存在可用选择标记有限、引入抗生素标记而产生生物安全隐患等等一些问题。此外，也存在耗时长，效率低等缺陷。

目前常用的基于CRISPR-Cas9系统的基因编辑技术因为能在基因组特定位点引入DNA 损伤，促使宿主体内DNA重组修复系统实施基因组修复，从而引入突变，提高重组效率，被广泛应用于包括人体细胞在内的各类生物(细胞)中。然而，随着研究的深入，越来越多的结果显示，异源表达这些核酸酶会对宿主产生不同程度的细胞毒性。这可能是截止目前为止，相关应用难在运动发酵单胞菌中开展的主要原因之一。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了基于运动发酵单胞菌內源CRISPR-Cas系统的基因组大片段高效删除方法及其应用。本发明的目的在于利用基于运动发酵单胞菌基因组编码的I-F型CRISPR-Cas系统的基因编辑平台，对其自身基因组上的大片段(10kb，约为基因组的5‰)进行敲除，为在该菌株及类似细胞中开展最小基因组细胞工厂的构建等研究工作提供高效的工具，促进代谢工程、系统生物学及合成生物学的发展。

本发明是这样实现的，基于运动发酵单胞菌內源CRISPR-Cas系统的基因组大片段高效删除方法，包括以下步骤：

步骤1：构建含人工CRISPR表达单元的质粒；