[发明专利]一种用于银杏愈伤组织诱导的无菌叶源的建立方法

说明书

本发明公开了一种用于银杏愈伤组织诱导的无菌叶源的建立方法，属于植物组织培养技术领域。本发明以银杏幼嫩枝条或成熟胚为材料，在芽诱导培养基或胚诱导培养基上培养40天，得到小苗或胚苗，剪获小苗的无菌叶片并将其原茎段基部斜切，或剪去胚苗的根，继续继代培养40天，再次剪获小苗或胚苗的无菌叶片后，将已去叶的抽长无菌嫩梢，剪成2‑3cm带芽的茎段，再在继代培养基上继续培养40天，以后可按茎段芽诱导、叶片抽出、收获叶片、茎段继续培养，反复进行，即得用于银杏愈伤组织诱导的无菌叶源，具有产量大、效率高，不受季节限制，持续稳定，源源不断的优点，所得无菌叶片可直接用于愈伤组织的诱导，具有很强的推广应用价值。

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种用于银杏愈伤组织诱导的无菌叶源的建立方法。

背景技术

银杏(Ginkgo biloba L.)是我国特有树种，其叶中含有2种重要的黄酮类和萜内酯类化合物，具有抗氧化、治疗心血管疾病的作用，因而具有重要的药用价值。目前银杏黄酮和萜内酯类化合物主要从银杏叶中提取，但含量低，且随着银杏树龄的增长逐年降低，生产上需要栽植大量的银杏幼林来生产银杏叶，占用大量的农田。田间种植的银杏叶片内含物含量高低受外界环境的影响较大，但人为较难控制环境的变化。近年逐渐发展起来的银杏愈伤组织和细胞培养技术，为银杏黄酮和内酯化合物的生产和代谢调控带来了新的生产和研究方式。银杏愈伤组织诱导可以通过胚、子叶、茎段、根等器官获得，但经大量的研究发现，叶片是诱导愈伤组织的最佳外植体。目前的愈伤组织诱导的方法是将直接来自于实生苗的叶片消毒后接种培养，由于叶片经消毒剂直接处理，受到伤害，接种后大部分褐化死亡，即使成活后诱导的愈伤组织生长能力差，继代几次后就会褐化死亡。另外要建立大规模和产业化的细胞培养系统，需要源源不断的叶片供应，但受季节的影响，只有春季的叶片可供愈伤组织诱导的叶源。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的在于提供一种用于银杏愈伤组织诱导的无菌叶源的建立方法，能持续稳定地、大量提供可用于愈伤诱导的无菌叶片，不受季节限制。

技术方案：为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种用于银杏愈伤组织诱导的无菌叶源的建立方法，包括如下步骤：

1)取银杏幼嫩枝条，去除叶片，或成熟银杏种子，剥去骨质中种皮，对其进行浸泡、清洗和消毒；

2)将银杏幼嫩枝条剪成2-5cm并带有1-3芽的茎段，接种在芽诱导培养基上培养40天，得到小苗；从银杏种子的胚乳中取出成熟胚，接种在胚诱导培养基上培养40天，得到胚苗；

3)剪下小苗的大叶片作为无菌叶，将其原茎段基部斜切，在继代培养基上继续培养40天；将胚苗的胚根剪除但不剪叶，在继代培养基上继续培养40天；

4)再次剪下小苗的大叶片作为无菌叶，并将已去叶的抽长无菌嫩梢去除原茎段，剪成2-3cm带芽的茎段，再在继代培养基上继续培养40天，再次得到小苗；剪下胚苗长出的大叶片，并将已去叶的抽长无菌嫩梢，剪成2-3cm带芽的茎段，再在继代培养基上继续培养40天，得到小苗；

5)对步骤4)中得到的小苗反复重复步骤3)和4)中小苗的操作，即得用于银杏愈伤组织诱导的无菌叶源。

优选地，步骤1)中所述的取银杏幼嫩枝条的方法为：于3月下旬～5月上旬，取银杏实生苗当年生的幼嫩枝条，或成年银杏雌、雄株当年生的幼嫩枝条。

优选地，步骤1)中所述的取银杏幼嫩枝条的方法为：对幼嫩枝条的叶片，进行黄酮和内酯含量的测定，筛选高含量的枝条作为初始接种的材料。