[发明专利]数字PCR检测长牡蛎多巴胺-β-羟化酶表达水平的引物及探针

说明书

本发明公开一种数字PCR检测长牡蛎多巴胺‑β‑羟化酶表达水平的引物及探针，所述引物及探针核苷酸序列如下：正向引物：5’‑tggcggaccactctctacatc‑3’；反向引物：5’‑tctccgcgacatcatctgaat‑3’；探针：5’‑cttcttccagctagcgaacgcaacaca‑3’；所述探针添加的荧光基团为6‑羧基荧光素。引物及探针的准确性和特异性高，故可利用数字PCR技术检测长牡蛎血淋巴细胞中NE合成酶CgDBH绝对量的时序变化，以此作为评价养殖长牡蛎健康状况的指标，所建立的评价体系在养殖贝类病害预警预报中具有潜在应用价值。不需要设置对照组，也无需内参基因（Internal control），突破了传统荧光实时定量PCR检测方法的应用局限。

技术领域

本发明属于分子生物学和生物化学技术领域，涉及一种数字PCR检测长牡蛎多巴胺-β-羟化酶表达水平的引物及探针。

背景技术

去甲肾上腺素(Norepinephrine, NE)属于儿茶酚胺类(Catecholamines, CAs)神经递质，是神经内分泌免疫系统中的重要调节分子。NE通过结合免疫细胞胞膜上的肾上腺素能受体（Adrenoceptor，ADR）来调节其免疫应答能力，同时，NE在不同的免疫内环境中结合不同类型的ADRs，产生不同的免疫调节效应。例如，在某些免疫细胞中α2 型肾上腺素能受体能通过 PKC 的活化、IκB 的磷酸化和 NF-κB 的激活，促进 TNF-α、IL-1、IL-6 和 IL-10 的产生和释放；β 型肾上腺素能受体（主要是 β2）通过 cAMP-PKA 通路，来抑制 NF-κB对免疫相关基因的转录。当α2 型肾上腺素能受体和β型肾上腺素能受体都被激活时，β型肾上腺素能受体的作用占优势。

近期的研究发现，贝类是具有完善神经内分泌免疫调节系统的最低等动物，NE在贝类免疫应答中发挥了至关重要的作用。鳗弧菌刺激后，栉孔扇贝血淋巴中NE的浓度显著上升，同时血淋巴细胞中NE合成酶（多巴胺-β-羟化酶，CgDBH）、CfMAO和 CfADR的 mRNA表达水平也显著升高。CfMAO被干扰后，血淋巴细胞中超氧化物歧化酶(CfSOD)的 mRNA 表达水平显著低于对照组。此外，研究发现LPS刺激能够诱导长牡蛎血淋巴细胞合成NE，进而调节血细胞的吞噬活性和凋亡指数。

荧光实时定量PCR（Quantitative real-time PCR，简称qPCR）是用于检测基因mRNA表达水平的经典方法。但此方法只能用于检测基因的相对表达水平，需要设置对照组并选取合适的管家基因作为内参，因此qPCR技术的应用具有很大局限性。相对地，数字PCR是一种核酸分子绝对定量技术，能够直接检出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量，符合野外调查的需要。但是，迄今为止，没有关于数字PCR检测长牡蛎多巴胺-β-羟化酶表达水平的引物及探针的相关报道，以至于并没有基于数字PCR检测长牡蛎多巴胺-β-羟化酶表达水平的时序变化并以此作为评价养殖长牡蛎健康状况的指标。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种数字PCR检测长牡蛎多巴胺-β-羟化酶表达水平的引物及探针。

本发明的技术解决方案是：一种数字PCR检测长牡蛎多巴胺-β-羟化酶表达水平的引物及探针，其特征在于所述引物及探针核苷酸序列如下：

正向引物：5’- TGGCGGACCACTCTCTACATC-3’；

反向引物：5’- TCTCCGCGACATCATCTGAAT-3’；

探针：5’- CTTCTTCCAGCTAGCGAACGCAACACA-3’；

所述探针添加的荧光基团为6-羧基荧光素。