[发明专利]一种抗口蹄疫病毒猪源单链基因工程抗体的制备方法

权利要求书

1.一种抗口蹄疫病毒猪源单链基因工程抗体的制备方法，包括以下步骤：

1)从免疫口蹄疫病毒抗原的猪血液样本中分离外周血单个核细胞；

2)对FMDV 146S抗原进行超滤离心，得到浓缩后的FMDV 146S抗原，使用染料对浓缩后的FMDV 146S抗原进行染色，将染色后的抗原进行超滤离心，得到标记后的FMDV 146S抗原；

3)将步骤1)得到的外周血单个核细胞与步骤2)得到的标记后的FMDV 146S抗原、鼠抗猪IgM-PE和鼠抗猪IgG-FITC荧光抗体混合，得到染色后的细胞；

4)使用多色流式细胞仪分选FMDV特异性单个B细胞；

5)对步骤4)得到的FMDV特异性单个B细胞进行反转录，得到cDNA后，利用如SEQ IDNO.1～16所示的引物进行巢式PCR扩增，得到猪IgG重链可变区基因、Lambda轻链可变区基因和Kappa轻链可变区基因；

6)将步骤5)得到的猪IgG重链可变区基因分别和Lambda轻链可变区基因、Kappa轻链可变区基因通过如SEQ ID NO.17所示的柔性Linker连接，在连接后的基因的N端分别引入如SEQ ID NO.18所述的信号肽序列，在C端分别引入Myc标签和His标签，参考Cricetulusgriseus密码子分别进行基因序列优化，在优化后的基因起始密码子前分别引入KOZAK序列，分别插入到pcDNA3.4表达载体，得到Lambda猪源单链抗体表达载体和kappa猪源单链抗体表达载体；

7)将步骤6)得到Lambda猪源单链抗体表达载体和kappa猪源单链抗体表达载体分别转染细胞进行抗体的表达；

所述步骤1)和2)没有时间先后顺序的限定。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述口蹄疫病毒包括O型FMDV、A型FMDV、C型FMDV、Asial型FMDV、SAT1型FMDV、SAT2型FMDV和SAT3型FMDV。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述猪血液样本为免疫口蹄疫病毒抗原14～30d的猪血液样本。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述染料包括FluoProbes647H染料或Pacific Blue染料。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述超滤离心为：使用截留量100kDa的超滤管4000rpm离心10min，将抗原或染色后的抗原置换至PBS缓冲液中。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4)所述分选为：把每孔含有10μL裂解液的96-PCR孔板放入分选舱，设置每孔分选1个细胞模式，上样；划门圈出淋巴及单核细胞，根据FSC-A与FSA-H设置排除粘连细胞，圈出对角线单一细胞，从中圈出IgG⁺IgM^-细胞群体，圈门分选IgG⁺IgM^-FMDV⁺细胞。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤6)使用Notl和Nhel酶切位点插入到pcDNA3.4表达载体。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤7)所述细胞包括CHO-S悬浮细胞。