[发明专利]一种基于人脑胶质瘤原代细胞建立荧光裸鼠肿瘤模型的方法

权利要求书

1.一种基于人脑胶质瘤原代细胞建立荧光裸鼠肿瘤模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、稳转细胞培养：采用改良DMEM/F12完全培养基进行细胞培养，大量扩增稳定表达荧光素酶的原代细胞；

所述稳定表达荧光素酶的原代细胞的构建方法为：体外分离获取人脑胶质瘤原代细胞，采用改良DMEM/F12完全培养基传代培养3~5代，之后应用慢病毒感染传代培养的原代细胞，经筛选得到稳定表达荧光素酶的胶质瘤细胞；

S2、细胞悬液准备：用改良DMEM/F12完全培养基反复清洗后，收集细胞悬液备用，细胞悬液浓度为6×10⁹个细胞/mL，悬液制备后在40min内使用；

S3、裸鼠胶质瘤模型建立：取步骤S2的悬液5-8μL缓慢注入小鼠颅内，定期监测裸鼠的后期反应，得到稳定表达荧光素酶的小鼠模型；

所述改良DMEM/F12完全培养基组成为：DMEM/F12培养基添加1×NeuroCult SM1Neuronal Supplement、10ng/mL人表皮生长因子、10μg/mL人重组胰岛素、100μg/mL肝素、10ng/mL霍乱毒素、1×谷氨酰胺及100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素。

2.如权利要求1所述的基于人脑胶质瘤原代细胞建立荧光裸鼠肿瘤模型的方法，其特征在于，步骤S1中，所述细胞培养具体包括以下步骤：

P1、将稳定表达荧光素酶的原代细胞接种于改良DMEM/F12完全培养基重悬，于37℃、5%CO₂条件下进行培养；

P2、培养至细胞丰度达到80%时，用PBS缓冲液漂洗细胞2次，加入1mL消化液消化单层细胞2-3min，所述PBS缓冲液的pH值为pH7.2-7.4；

P3、加入2mL改良DMEM/F12完全培养基终止消化，低速离心去上清，收集细胞沉淀，再用1mL改良DMEM/F12完全培养基重悬后补足培养基，按照1传2的比例进行培养，连续传代20代后，备用。

3.如权利要求1或2所述的基于人脑胶质瘤原代细胞建立荧光裸鼠肿瘤模型的方法，其特征在于，所述改良DMEM/F12完全培养基需经过0.22um孔径滤膜过滤后使用。

4.如权利要求2所述的基于人脑胶质瘤原代细胞建立荧光裸鼠肿瘤模型的方法，其特征在于，步骤P2中，所述消化液为含有1×I型胶原酶和0.25%胰酶-0.2%EDTA的消化液。

5.如权利要求2所述的基于人脑胶质瘤原代细胞建立荧光裸鼠肿瘤模型的方法，其特征在于，步骤P3中，所述低速离心条件为：1000rpm离心4min。

6.如权利要求1所述的基于人脑胶质瘤原代细胞建立荧光裸鼠肿瘤模型的方法，其特征在于，步骤S1中，所述稳定表达荧光素酶的原代细胞的构建方法为：体外分离获取人脑胶质瘤原代细胞，传代培养3~5代，将荧光素酶慢病毒表达载体与慢病毒包装质粒混合后，共转染293T细胞，以产生含有萤火虫荧光素酶的慢病毒上清，确定慢病毒的滴度，应用上述慢病毒感染传代培养的原代细胞，经筛选得到稳定表达萤火虫荧光素酶的胶质瘤细胞。

7.如权利要求6所述的基于人脑胶质瘤原代细胞建立荧光裸鼠肿瘤模型的方法，其特征在于，所述荧光素酶慢病毒表达载体与慢病毒包装质粒分别为：pcDNA3.0-Luc和pLent-U6-GFP-Puro。

8.权利要求1或2或4~7任一项所述的基于人脑胶质瘤原代细胞建立荧光裸鼠肿瘤模型的方法在构建人脑胶质瘤荧光裸鼠肿瘤模型中的应用。