[发明专利]提高光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂包涵体蛋白复性方法

说明书

本发明旨在提供一种光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂融合蛋白TrxA‑ApSerpin‑FA72包涵体蛋白复性及活性的方法。本发明采用在变性液中添加尿素，并使用盐酸胍稀释复性的方法对光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂融合蛋白TrxA‑ApSerpin‑FA72包涵体蛋白进行活化，在整个蛋白复性过程控制蛋白浓度在1‑10μg/mL，获得的重组蛋白TrxA‑ApSerpin‑FA72在pH=7~9，60℃对丝氨酸蛋白酶的抑制活性高达95%以上，能够有效获得具有活性的重组蛋白TrxA‑ApSerpin‑FA72，为后续进一步研究光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂的功能奠定基础。

发明领域

本发明属于活性蛋白的制备技术领域，具体的，本发明涉及一种显著提高光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂包涵体蛋白复性及活性的方法的技术领域。

背景技术

丝氨酸蛋白酶抑制剂一般由约400个氨基酸残基组成的单链的蛋白质，蛋白质的中心由9个α螺旋包围，并且组成了3个β折叠，同时其活性反应中心环(RCL)一般远离丝氨酸蛋白酶抑制剂的中心，在抑制剂的羧基末端约30-40个残基的位置。光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂ApSerpin-FA72是丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族的成员，Kazal型蛋白酶抑制剂，参与丝氨酸蛋白酶水解级联作用的负调控。丝氨酸蛋白酶抑制剂在酚氧化酶原的激活与抗菌肽的表达也起着负调控作用，还具有抑制昆虫的消化酶作用，调节炎症与凝血等作用。

新疆地处欧亚大陆腹地，气候干旱，其中鞘翅目(Coleoptera)昆虫是最具有代表性的一类昆虫，光滑鳖甲Anatolicapolitaborealis隶属于拟步甲科(Tenebrionodae)鳖甲族(Tenyriini)鳖甲属Anatolica是一类广泛分布的荒漠昆虫，光滑鳖甲可能存在独特的免疫调控防御机制。其中丝氨酸蛋白酶抑制剂可能在其独特免疫调控防御机制过程中起关键作用。

在基因工程发展的过程中，大肠杆菌作为原核表达系统，外源基因在大肠杆菌中高表达时，会形成高密度、不溶性蛋白颗粒，同时也不具有生物学活性，需要进行复性后才可以恢复生物学活性。因此，蛋白以包涵体的形式表达时，包涵体的复性是生产蛋白的关键技术，不同的包涵体使用不同的去污剂与变性剂进行处理，经洗涤、溶解、复性得到有生物活性的蛋白。

目前，已有专利CN109251936A中已经披露了一种光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂融合蛋白TrxA-ApSerpin-FA72的制备方法。但构建的工程菌株pET32a-ApSerpin-FA72/BL21，经诱导在大肠杆菌内正常表达，由于蛋白表达量过高，融合蛋白主要以包涵体形式存在，经破碎表达在菌体上清中目的蛋白远远小于包涵体蛋白，因此，为了获得大量的有活性的高纯度丝氨酸蛋白酶抑制剂，本发明提供了一种提高光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂融合蛋白TrxA-ApSerpin-FA72包涵体蛋白复性及活性的方法。为后续为进一步研究光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂的功能奠定基础。

发明内容

针对现有技术中制备的光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂纯度低，活性弱的技术问题，本发明旨在于提供一种显著提高光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂融合蛋白TrxA-ApSerpin-FA72包涵体蛋白复性及活性的方法。本发明通过提供提高光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂融合蛋白TrxA-ApSerpin-FA72包涵体蛋白复性及活性方法能够使诱导表达的高浓度包涵体融合蛋白有效富集，处理后显著提高了蛋白活性，解决了当前重组蛋白TrxA-ApSerpin-FA72的获取主要为无活性的包涵体蛋白，且尚无相关显著提高重组蛋白TrxA-ApSerpin-FA72包涵体蛋白活性的复性方法报道的技术难点，为后续为进一步研究光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂的功能奠定基础，对其分子机制的研究为荒漠昆虫独特的免疫调控防御机制提供依据。

本发明提供一种显著提高光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂融合蛋白TrxA-ApSerpin-FA72包涵体蛋白复性及活性的方法，其具体方法步骤如下：